Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten
Summary
Verfahren zur Kultur von Endothelzellen eine Monoschicht der gesamten inneren Oberfläche des 3D einer Mikrofluidikvorrichtung mit mikrovaskulären großen Kanälen (<30 um) beschrieben. Dies<em> In-vitro-</em> Mikrovaskulatur Modell ermöglicht die Untersuchung der biophysikalischen Wechselwirkungen zwischen Blutzellen, Endothelzellen, und löslichen Faktoren in hämatologischen Erkrankungen.
Abstract
Advances in Mikrofabrikationstechniken haben die Produktion von kostengünstigen und reproduzierbaren mikrofluidischen Systemen für die Durchführung von biologischen und biochemischen Experimenten auf der Mikro-und nanoskaligen 1,2 aktiviert. Darüber hinaus haben Mikrofluidik ebenfalls speziell verwendet, um quantitativ zu analysieren hämatologischen und mikrovaskulären Verfahren, wegen ihrer Fähigkeit, eine einfache Steuerung der dynamischen Strömungsumgebung und biologischen Bedingungen 3-6. Als solche haben die Forscher in jüngerer Zeit mikrofluidischen Systemen verwendet werden, um Blutkörperchen Verformbarkeit, Blutkörperchen Aggregation, mikrovaskuläre Blutfluss und Blutkörperchen-Endothelzell-Interaktionen 6-13 studieren. Allerdings sind diese mikrofluidischen Systemen entweder gar nicht zählen kultivierten Endothelzellen waren größer oder als die sizescale relevanten mikrovaskulären pathologischen Prozessen. Ein mikrofluidischen Plattform mit kultivierten Endothelzellen, dass genau rekapituliert die zelluläre, physikalischen und hemodynAmic Umfeld der Mikrozirkulation wird benötigt, um unser Verständnis der zugrunde liegenden biophysikalischen Pathophysiologie von hämatologischen Erkrankungen, die eine erneute Mikrovaskulatur.
Hier berichten wir über eine Methode, um eine "endothelialisierten" In-vitro-Modell der Mikrovaskulatur erstellen, mit Hilfe eines einfachen, einzigen Maske Mikrofabrikationsprozessen in Verbindung mit Standard Endothelzellkultur Techniken, zu pathologischen mikrovaskulären biophysikalischen Interaktionen, die in hämatologischen Erkrankungen auftreten, zu studieren. Diese "Mikrovaskulatur-on-a-Chip" bietet die Forscher mit einem robusten Assay, die eng kontrolliert biologischem sowie biophysikalischen Bedingungen und wird mit einer Standard-Spritzenpumpe und Hellfeld / Fluoreszenzmikroskopie. Parameter wie mikrozirkulatorischen Vorraussetzungen, Endothelzellen Typ, Blut Zelltyp (en) und Konzentration (en), Arzneimittel / Hemmkonzentration usw., sind bequem gesteuert. Als solche bietet unser Mikrosystemtechnikeine Methode, um quantitativ zu untersuchen Krankheit Prozesse, in denen mikrovaskulären Flusses aufgrund der Veränderungen von Zell-Adhäsion, Aggregation und Verformbarkeit, eine Fähigkeit, nicht verfügbar mit den bestehenden Assays beeinträchtigt wird.
Protocol
Discussion
Unsere endothelialisierten Kleinstgerätes System eignet sich am besten in Verbindung mit in-vivo-Experimenten verwendet und seine reduktionistische Ansatz kann dazu beitragen, Aufklärung der biophysikalischen Mechanismen von hämatologischen Prozesse, die beim Menschen und im Tiermodell beobachtet werden. Darüber hinaus ist unser System nicht ohne Einschränkungen. Zum Beispiel sind unsere mikrofluidischen Kanälen im Querschnitt quadratisch. Obwohl technisch kreisförmigen Mikrokanäle 10,11 herg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken T. Hunt, M. Rosenbluth, und das Lam-Lab für ihre Ratschläge und nützliche Diskussionen. Wir erkennen die Unterstützung von G. Spinner und dem Institut für Elektronik und Nanotechnologie an der Georgia Institute of Technology. Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde durch ein NIH-K08 HL093360, UCSF REAC award, einem der NIH Nanomedizin Development Center Award PN2EY018244, und die Finanzierung aus dem Zentrum für Endothelial Cell Biology von Kinder-Healthcare von Atlanta zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2″, pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020″ ID x 0.060″ OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012″ ID x 0.030″ OD |
References
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. v. a. n. d. e. r., Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Karunarathne, W., Ku, C. -. J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
