Hematologic रोग में Microvascular सहभागिता का अध्ययन करने के लिए endothelialized Microfluidics
Summary
पूरे में microvascular आकार चैनल (<30 माइक्रोन) के साथ एक microfluidic डिवाइस के भीतर 3D सतह भर में एक endothelial सेल monolayer संस्कृति विधि वर्णित है. यह<em> इन विट्रो में</em> Microvasculature मॉडल रक्त कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं और hematologic रोगों में घुलनशील कारकों के बीच biophysical बातचीत के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है.
Abstract
तकनीक microfabrication अग्रिम में 1,2 और सूक्ष्म nanoscales में जैविक और जैव रासायनिक प्रयोगों का आयोजन करने के लिए सस्ती और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सिस्टम microfluidic के उत्पादन में सक्षम है. इसके अलावा, Microfluidics को भी विशेष रूप से किया गया है करने के लिए मात्रात्मक hematologic और microvascular प्रक्रियाओं का विश्लेषण उनके लिए आसानी से गतिशील fluidic पर्यावरण और जैविक 3-6 शर्तों को नियंत्रित करने की क्षमता की वजह से, इस्तेमाल किया. जैसे, शोधकर्ताओं और अधिक हाल ही में microfluidic प्रणालियों का इस्तेमाल किया है रक्त कोशिका विरूपता, रक्त कोशिका एकत्रीकरण, microvascular रक्त प्रवाह, और रक्त सेल endothelial सेल बातचीत 6-13 का अध्ययन हालांकि, इन microfluidic सिस्टम या तो सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं को शामिल नहीं किया है या बड़े थे. sizescale प्रासंगिक microvascular वैकृत प्रक्रिया की तुलना में. सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं के साथ एक microfluidic मंच कि सही का स्मरण दिलाता है सेलुलर, शारीरिक, और hemodynmicrocirculation के अमोनियाई वातावरण hematologic रोगों कि microvasculature शामिल की अंतर्निहित biophysical pathophysiology के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने की जरूरत है.
यहाँ, हम एक विधि इन विट्रो मॉडल में microvasculature के एक "endothelialized" बनाने के लिए, मानक endothelial सेल संस्कृति तकनीक, वैकृत biophysical microvascular बातचीत कि hematologic रोग में होने का अध्ययन करने के साथ संयोजन के रूप में एक सरल, एकल मुखौटा microfabrication प्रक्रिया का उपयोग कर रिपोर्ट. यह एक मजबूत परख कि कस के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जैविक के biophysical स्थितियों पर नियंत्रण और एक मानक सिरिंज पंप और brightfield / प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर संचालित के साथ शोधकर्ता "microvasculature पर-a-चिप" प्रदान करता है. Microcirculatory hemodynamic शर्तों, endothelial सेल प्रकार, रक्त कोशिका प्रकार (ओं) और एकाग्रता (एस), दवा / निरोधात्मक एकाग्रता आदि, जैसे पैरामीटर सब आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है. जैसे, हमारे माइक्रोसिस्टम प्रदान करता हैमात्रात्मक रोग प्रक्रियाओं जो में microvascular प्रवाह के कोशिका आसंजन, एकत्रीकरण, और विरूपता, एक मौजूदा assays के साथ अनुपलब्ध क्षमता में परिवर्तन के कारण बिगड़ा हुआ है की जांच के लिए विधि.
Protocol
Discussion
हमारे endothelialized microdevice प्रणाली सबसे अच्छा है जब, vivo प्रयोगों में साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया अनुकूल है, और अपने न्यूनकारी दृष्टिकोण hematologic प्रक्रियाओं है कि मानव और पशु मॉडल में मनाया जाता है biophysical…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम टी. हंट, एम. Rosenbluth, और उनकी सलाह और उपयोगी विचार – विमर्श के लिए लैम लैब धन्यवाद. हम जी स्पिनर और इलेक्ट्रॉनिक्स और जॉर्जिया प्रौद्योगिकी संस्थान में नैनो के लिए संस्थान से समर्थन स्वीकार करते हैं. एक NIH K08 – HL093360 अनुदान, UCSF reac पुरस्कार, एक NIH Nanomedicine विकास और केंद्र PN2EY018244 पुरस्कार, और बच्चों के अटलांटा के हेल्थकेयर के Endothelial सेल बायोलॉजी के लिए केंद्र से धन के द्वारा इस कार्य के लिए वित्तीय समर्थन प्रदान किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2″, pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020″ ID x 0.060″ OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012″ ID x 0.030″ OD |
References
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. v. a. n. d. e. r., Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Karunarathne, W., Ku, C. -. J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
