Endotelialiserade Mikrofluidik för att studera Mikrovaskulära Interaktioner i hematologiska sjukdomar
Summary
En metod att odla en endotelcell monoskikt under hela inre 3D ytan av en mikrofluidanordning med mikrovaskulär storlek kanaler (<30 pm) beskrivs. Detta<em> In vitro</em> Mikrovaskulaturen modell möjliggör studiet av biofysikaliska interaktioner mellan blodceller, endotelceller och lösliga faktorer i hematologiska sjukdomar.
Abstract
Advances in mikrotillverkningstekniker har möjliggjort produktion av billiga och reproducerbar mikrofluidiksystem för utförande biologiska och biokemiska experiment på mikro-och nanoscales 1,2. Dessutom har mikrofluidik också specifikt används för att kvantitativt analysera hematologiska och mikrovaskulär processer, på grund av deras förmåga att enkelt styra den dynamiska fluid miljö och biologiska förhållanden 3-6. Som sådan har forskare på senare tid används för mikroflödessystem system för att studera deformerbarhet blodkroppar, blodkroppar aggregering, mikrovaskulära blodflödet, och blod cell-endotel interaktioner 6-13. Dessa mikroflödessystem system antingen inte innehöll odlade endotelceller eller var större än sizescale relevant för mikrovaskulära patologiska processer. En mikrofluidisk plattform med odlade endotelceller som korrekt rekapitulerar den cellulära, fysikaliska och hemodynAmic miljö mikrocirkulationen behövs för att främja vår förståelse av den underliggande biofysiska patofysiologi hematologiska sjukdomar som involverar mikrocirkulation.
Här rapporterar vi en metod för att skapa en "endotelialiserade" in vitro modell av mikrovaskulaturen, med hjälp av en enkel, enhetlig process mask mikrofabrikation i samband med standard endotelceller cellodlingstekniker, för att studera patologiska biofysiska mikrovaskulära samspel som sker i hematologiska sjukdomar. Denna "mikrocirkulation-on-a-chip" ger forskaren en robust analys som tätt kontrollerar både biologiska och biofysiska förhållanden och drivs med en vanlig spruta pump och brightfield / fluorescensmikroskopi. Parametrar såsom förhållanden mikrocirkulatoriska hemodynamiska, endotelcell typ, blodkroppar typ (er) och koncentration (er), drog / hämmande koncentration etc. kan alla vara lätt att kontrollera. Som sådan tillhandahåller vår mikrosystemen metod för att kvantitativt undersöka sjukdomsprocesser som mikrovaskulära flöde nedsatts på grund av förändringar i cell adhesion, aggregation och deformerbarhet, en förmåga tillgänglig med befintliga analyser.
Protocol
Discussion
Vårt endotelialiserade mikroanordning system lämpar sig bäst när den används tillsammans med in vivo experiment och dess reduktionistiskt synsätt kan hjälpa belysa biofysiska mekanismer hematologiska processer som observerats hos människa och djurmodeller. Dessutom är vårt system inte utan begränsningar. Exempelvis våra mikrofluidiska kanaler är kvadratiskt i tvärsnitt. Även tekniskt cirkulära mikrokanaler kan tillverkas 10,11, valde vi att använda ett enklare och standard tillverkni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar T. Hunt, M. Rosenbluth och Lam Lab för deras råd och nyttiga diskussioner. Vi erkänner stöd från G. Spinner och Institutet för elektronik och nanoteknologi vid Georgia Institute of Technology. Ekonomiskt stöd till detta arbete gavs av en NIH bidrag K08-HL093360, UCSF REAC utmärkelse, en NIH nanomedicin Development Center Award PN2EY018244 och finansiering från Centrum för Endothelial Cell Biology av barns Healthcare of Atlanta.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2″, pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020″ ID x 0.060″ OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012″ ID x 0.030″ OD |
References
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. v. a. n. d. e. r., Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Karunarathne, W., Ku, C. -. J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
