Biz kemirgen embriyolardan hipokampal ve kortikal nöronlar yalıtmak ve kültürüne hızlı bir metodoloji tanıtılmıştır. Bu protokol bize neredeyse saf nöronal kültürlerin gerekli olduğu deneyler yapmasına imkan tanıyor.
Biz E15-17 rat embriyoları hipokampal veya kortikal nöronların ayırmak ve kültür için hızlı bir yöntem tarif edilir. Prosedürü fare ve insan birincil nöronlar ve sinir progenitörlerin izolasyonu başarıyla uygulanabilir. Ayrışmış nöronlar ila birkaç hafta serum içermeyen aracı madde içinde muhafaza edilir. Bu kültürler nucleofection, immünsitokimya, nükleik asit hazırlanması yanı sıra elektrofizyoloji için de kullanılabilir. Büyük nöronal kültürler da iyi bir verim lentiviral transdüksiyonu ile oranı ve daha az etkin bir şekilde, kalsiyum fosfat ya da bu gibi lipid lipofektamin bazlı yöntem ile transfekte edilebilir.
Rat hipokampal ve kortikal nöronların diseksiyon ve kültür yöntemi burada açıklanan kimyasal olarak tanımlanmış bir orta (Şekil 3) yetiştirilen yaklaşık saf nöronal kültürlerin kullanıldığı deneyler sağlar. Serumsuz medya kültürü neredeyse saf nöronlar için protokolleri daha önce 2,3,4 tanımlanmış olmasına karşın, bizim yöntem yapılan önemli değişiklikler vardır. Geleneksel protokolleri farklı (yani Banker ve ark.) 5, biz TrypLE Express, dah…
The authors have nothing to disclose.
Biz editoryal yardım için Jonna Ellis teşekkür ederim. Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü: açıklanan proje Ödülü Numarası R01MH079751 (F. Peruzzi PI) tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ruh Sağlığı Ulusal Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez.
Reagent | Concentration |
Neurobasal | 98% |
B27 | 2% |
Glutamax | 0.5 mM |
Table I. Neurobasal/B27 complete medium.
Reagent | Concentration |
Glucose | 16 mM |
Sucrose | 22 mM |
HEPES | 10 mM |
NaCl | 160 mM |
KCl | 5 mM |
Na2HPO4 | 1 mM |
KH2PO2 | 0.22 mM |
Gentamicin | 50 μg/ml |
Fungizone | 250 ng/ml |
pH | 7.4 |
Osmolarity | 320-330 mOsm |
Table II. Dissection medium.
Reagent | Volume (μl) |
Neurobasal/B27 complete medium | 240 |
Trypan Blue Stain 0.4% | 250 |
Total | 490 |
Table III. 50x Counting solution.
Reagent | Company | Cat. number |
Hibernate E | Brainbits | 767171 |
Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G1264 |
Glutamax 200 mM | Gibco, Invitrogen | 35050 |
TrypLE Express w/o phenol red | Gibco, Invitrogen | 12604 |
Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 |
Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 |
Laminin 1 mg/ml | Millipore | CC095 |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
Table IV. Specific reagents.
Equipment | Company | Cat. number |
Stereo Microscope | Olympus | SZ61 |
Large Forceps | FST | 11022-14 |
Fine-tipped forceps | Moria | MC40B |
Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 |
Razor-sharp scissors | Roboz | RS-6820 |
Micro Dissecting scissors | FST | 91460-11 |
Micro Dissecting Curved scissors | FST | 14067-11 |
Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 |
60 mm dishes | BD Falcon | 353002 |
100 mm dishes | Corning | 430167 |
15 ml tubes | BD Falcon | 352099 |
1.5 ml cryo-tube vial | Nunc | 375353 |
Table V. Specific equipment.