Raman spektroskopi er en egnet teknikk for ikke-kontakt, label-fri analyse av levende celler, vev-teknikk konstruerer og innfødte vev. Kildespesifikk spektrale fingeravtrykk kan genereres og analyseres ved hjelp av multivariat analyse.
Ikke-destruktiv, ikke-kontakt og label-fri teknologi for å overvåke celle og vevskulturer er nødvendig innen biomedisinsk forskning. 1-5 Men foreløpig tilgjengelige rutinemetoder krever foredlingsledd og endre prøven integritet. Raman spektroskopi er en rask metode som muliggjør måling av biologiske prøver uten behov for ytterligere foredlingsledd. . Denne laser-basert teknologi oppdager uelastisk spredning av monokromatisk lys 6 Som enhver kjemisk vibrasjon er tildelt en bestemt Raman band (wavenumber i cm -1), har hver biologisk prøve en typisk spektral mønster på grunn av sin iboende biokjemiske sammensetningen 7. – 9 Innenfor Raman spektra, peak intensitet korrelerer med mengden av dagens molekylære obligasjoner. 1 Likheter og forskjeller i de spektrale datasettene kan oppdages ved å ansette en multivariat analyse (f.eks prinsipal komponent analyse (PCA)). ti </sup>
Her utfører vi Raman spektroskopi av levende celler og vev innfødte. Cellene er enten sådd på glassbunn retter eller holdt i suspensjon under normale cellekulturer forhold (37 ° C, 5% CO 2) før måling. Native vev blir dissekert og lagres i fosfatbufret saltvann (PBS) ved 4 ° C før målinger. Avhengig av vår eksperimentelle oppsett, vi så enten fokusert på cellekjernen eller ekstracellulær matrix (ECM) proteiner som elastin og kollagen. For alle studier, er et minimum av 30 celler eller 30 tilfeldige severdigheter innenfor ECM målt. Databehandling steg med bakgrunn subtraksjon og normalisering.
Raman spektroskopi er et egnet verktøy for å analysere biologiske prøver, for eksempel in vitro-dyrkede celler og ECM proteiner samt celler i løpet av innfødte vev. 11,15,16 Her viste vi at dette ikke-kontakt, lar label-fri teknikk i diskriminering av ulike celletyper og påvisning av ECM protein degradering utelukkende basert på den iboende biomolekylære sammensetningen av disse biologiske prøver.
Den store fordelen med Raman spektroskopi er evnen til ikke-invasiv kvantifisere den biokjemiske fingeravtrykk av en prøve ved sin resulterende Raman spektra. I motsetning til infrarød spektroskopi, som gir tilsvarende opplysninger, kan Raman spektra hentes fra vandige prøver, som Raman scatter fra vann er svak. I tillegg er Raman-spektroskopi utelukkende basert på påvisning av tilbakespredning av monokromatisk lys, derfor er ikke prøvebehandling nødvendig før måling. Disse egenskapene gjør RaMannen spektroskopi et lovende alternativ for potensielle in vivo bildebehandlingsprogrammer. I denne hilsen, er sammenhengende anti-Stokes Raman spektroskopi (CARS) en meget interessant teknikk fordi det gir raskere og mer sensitive kjøp av data basert på de samme vibrasjonelle signalene benyttes i våre eksperimenter. 15,16 Andre alternative metoder, inkludert multiphoton-indusert autofluorescens og andre harmonisk generasjon bildebehandling tidligere har blitt vist seg å være egnet for overvåking av biologiske prøver ikke-eller minimal invasiv. 17 Imidlertid er disse bildediagnostikk assosiert med svært høye kostnader og er begrenset til autofluorescens genererer molekyler. I tillegg er Raman spektrometer lett å kombinere med konvensjonelle optiske mikroskoper. Disse egenskapene gjør Raman spektroskopi et verdifullt verktøy for å studere biologiske prøver i fysiologiske miljøer.
En av dagens begrensninger i vår Raman spektroskopi satt opp erden relativt lille laser fokus (250 nm full bredde halv maksimum (FWHM) lateral og 700 nm FWHM aksial) som er skapt av en høy numerisk apertur objektiv (NA = 1,2). Selv om en høy numerisk apertur tillater å dekke en god mengde av utsendt Raman lys som gir et høyt signal-til-støy-forhold, produserer høy NA bare en liten samling fokus i utvalget som er typisk mye mindre enn en celle. For å sammenligne Raman spektra av ulike celler, er samlingen av en representant spektrum vesentlig, noe som er vanskelig å få med et lite fokusområde. For å løse dette problemet, jobber vi med en prosess for å automatisere signalet samling på ulike punkter i cellen (= Raman spektroskopi kartlegging), som resulterer i en spektral snitt og gi etter for et representativt spekter. I tillegg vil denne teknikken gi en oversikt over fordelingen av spesifikke Raman band, for eksempel av proteinet distribusjon innenfor en celle.
Biological prøver er svært komplekst og består av en heterogen blanding av biomolekyler som bidrar til samlet Raman spektrene. Derfor er det spektrale mønsteret svært komplekst og overvåking av en enkelt type av et molekyl i en Raman spektrum er vanskelig å oppnå med overlapping av ulike molekyl signaler. I tillegg kan iboende fluorescens i prøven maskere verdifull informasjon om svakere Raman signaler. Interessant, i noen av våre tidligere studier, identifiserte vi autofluorescens i Raman spektrene som den viktigste skille faktor mellom celletyper (MSCS og fibroblaster) ved hjelp av en passende analyseverktøy. 13 Vi identifiserte også at endringer i den totale Raman signal intensitet kan tjene som en indikator for tilstanden i kollagen og kollagenfibre innenfor ECM av aortaklaffen brosjyrer. 9 Men når analysere tilstanden elastin i disse vev, var vi ikke i stand til å oppdage lignende resultater. Som nevnt i resultatets del, var vi bare i stand til å oppdage endringer i spesifikke Raman band i elastase-behandlede prøver i forhold til de innfødte kontrollene. Vi så ikke en nedgang av den totale Raman signal i enzymatisk behandlet prøvene som forventet. Disse observasjonene førte en score plott som ikke avslører noen klar klynge formasjon som i forrige undersøkelse. 9 I kontrast, ble påvirket av den enzymatiske behandlingen oppdages innenfor PCA resultatene. Vi antar at disse avvikene mellom de to ECM proteiner, elastin og kollagen, er basert på morfologiske forskjeller og ulike enzymatisk nedbrytning prosesser: i aortaklaffen pakningsvedlegget, er kollagen-rik sone (fibrosa) en sammenhengende lag som blir løsnet på grunn av enzymatisk behandling, der elastin inneholder sone (ventricularis) har en nettverkskonfigurasjon som vises fragmentert etter eksponering for elastase (Fig. 4). Enkelt sted målinger var derfor ikke hensiktsmessigspiste å oppdage slike små brudd i elastin nettverket. Her vil en Raman kartlegging av vev bidra til å identifisere nettverket sammenbrudd.
En ytterligere utfordring i Raman spektroskopi av biologiske prøver er å redusere måleresultatene ganger. En løsning er å øke laser makt, noe som er egnet så lenge de biologiske prøvene ikke påvirkes av foto-skade. Alle våre nåværende eksperimenter er proof-of-prinsippet studier som fokuserer på grunnleggende forskning, men er vårt overordnede mål å gjennomføre Raman spektroskopi for kliniske applikasjoner, inkludert regenerativ medisin (f.eks kvalitetskontroll av vev-konstruerte produkter), pre-transplantasjon pode overvåking og kreftdiagnostikk.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Steffen Koch for sin tekniske støtte og Shannon Lee Layland (både Fraunhofer IGB Stuttgart) for hans nyttige forslag på manuskriptet. Dette arbeidet ble finansielt støttet av Tiltrekke program av Fraunhofer-Gesellschaft og BMBF (både til KS-L.).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
elastase | Worthington | LS006363 | |
anti-elastin antibody | Sigma | HPA018111 | 1:75; citrate buffer |
PBS | Lonza | 17-512F | |
glass bottom dishes | Greiner BioOne | 627860 | |
The Unscrambler | CAMO | ||
Opus | Bruker |