並列共焦点顕微鏡を使用して複数のセルの動力学的データの取得の高速化、高解像度、MTPA-GFPベースのミトコンドリア融合アッセイ

Summary

ミトコンドリアの融合は、時間をかけてネットワークを介してミトコンドリアのマトリックスphotoconvertedをターゲットとしたGFPの平衡を追跡することによって測定した。これまでのところ、1つだけのセルが同時に時間の長い運動解析に供することができます。我々はこれにより、データ収集プロセスをスピードアップ、同時に複数のセルを測定する手法を提案する。

Abstract

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.

Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis^1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks^4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function¹⁸. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust¹⁴. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis⁹. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.

Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay⁷, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay^1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process ^4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.

A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)^6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal⁶. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE^9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.

The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity^8,15,16,17.

In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE⁸ in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO₂, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Protocol

1。イメージングプレートの準備 10パーセント標準のウシ胎児血清を含むRPMI培地で培養INS1細胞、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、50μM2 -メルカプトエタノール、5mMのNaHCO 3を 、2 mMのHEPES、2mMのピルビン酸、11 mMグルコース80％コンフルエントに。 0.05％トリプシンおよびプレートそれらのポリ-D-リジンコートしたカバースリップ底イメージングプレート（30〜40％コンフルエント）上でINS1細胞培養をトリプシン処理。 24時間（MOI = 5）プレート60-80％のコンフルエント（〜2日）に到達し、ミトコンドリアのマトリックスが標的に追加する（COXVIII）アデノウイルスは、PA-GFPを可能にします。交換媒体、細胞、イメージングの前に別の2日間に成長することができます。 イメージングの日に、イメージングプレートに7から15 nMのTMREを追加し、少なくとも45分間平衡化します。 インキュベーターのこの時間のターン（ステージ上のインキュベータは、ここで使用されている）の間に、顕微鏡°Cで約1時間37に平衡化することができます。 5％のCO 2をオンにします。 </LI> 2。ツァイスLSM 710共焦点顕微鏡用撮像パラメータ顕微鏡で平衡化した後、取得タブの下に、パネルを設定し、撮像を開き、 "ショーマニュアルツール"をクリックし、 "チャネルモード"を選択し、すべての "フレーム"を追跡する切り替えます。 光パスパネルでは、LSMおよびチャネルモードを選択します。標本のアイコンから作業して上向きに、690 +、およびMBS 488 "リア"、MBSを選択します。パネルの下部にある、明るいフィールドまたはDICチャネルの可視化を有効にするには、 "T-PMT"を選択します。 GFPの色素のために490から540 nmへとTMRE色素のために580から700 nmまでの範囲を設定することにより、光パスのパラメータを調整して終了します。 アクイジション·モードでは、512×512ピクセルのスキャンフィールド、平均4倍を使用して、（キャリブレーションの目的のために一貫性を維持したい場合があります）ズーム倍率を選択します。 3。撮像パラメータの最適化 FOCは、プランアポクロマート100倍（1.4 NA）の対物レンズを使用して、毒性からミトコンドリア保護するためにハロゲンライトではなく、蛍光灯、とあなたの細胞上に私達。 PA-GFPは最大限に開いたピンホールを用いて細胞を発現し、明るい緑色であるセルを見つけるためにスキャンするための画面が表示されます。 PA-GFPを有効にして、信号が検出器を飽和させないことを保証する撮像パラメータを最適化するために必要な2光子レーザーの最も低消費電力を見つける。 PA-GFPシグナルはいくつかのZシリーズ用TMRE信号と共局在することを確認してください。 TMRE信号の損失は、ミトコンドリアの脱分極または毒性を示し、これらの特性を示す細胞を解析に使用すべきではありません。 PA-GFP発現細胞を見つけて、ズームの倍率を指定します。 6スライス（特定のZ-フォーカスが各位置で設定されていない限り、この範囲がすべての10個の細胞を満足する必要があります）収集するためにZシリーズの範囲を設定します。 各セル（セル1、セル2など）のイメージング法を保存します。 4。自動化を調整するDプログラムの部分と、あなたが1時間ミトコンドリア融合アッセイのためにウィル·フォロー10セルを指定します multitimeウィンドウの左側のパネルで、 "省エネルギー"パネルを選択し、ファイルが保存される場所を指定します。 "取得"パネルで、スキャン設定で、セル1のために保存、取得メソッドをロードおよびzスタックのチェックボックスをオンにします。また、 "ZスタックのZ-中央マーク"を選択します。 "ブロック"パネルで、 "それぞれの場所で単一のブロック"を選択してください。測定する間隔ごとに "追加のブロック"をクリックしてください。 "タイミング"パネルで、 "最初の場所だけでブロックするまでの待機間隔"の "間隔を待つ"と入力し、 "0"を選択してください。ブロック2-4は、このセクションの "15分"になります。 場所パネルのと、 "場所との間の位置をロードするためにフォーカスを移動"を選択し "'次のLOC'をクリックするか、 'は、LOCに移動する"ときに設定スキャン負荷の下で "編集場所のリスト"を選択し、 "複数"を選択して、 "すべてをクリア場所は "ステージを電動。 UNDER "ブリーチ"パネルは、 "漂白剤"ボックスをクリックし、 "設定"で設定ファイルを指定するプルダウンメニューなどの主要なソフトウェアのウィンドウで指定された。そして、 "漂白"ウィンドウで、適切な光活性化の方法を保存します。地域のパネルでは、この特定のセルのROIを選択し、ウィンドウの "ROIのリストに現在の領域を追加する"を選択してmultitimeこのROIを追加します。 "ROI"のプルダウンメニュー内の同じ場所を選択してください。 タイミングが正しく機能するためには、各セルは15分間隔を持っているため、2つの方法が保存する必要があります。ブロックのリストには、一つ目は "本当の"光活性化の構成を持って、残りは二光子レーザーを使用していません "モック"の設定があります。最初のブロックはまた遅延（BKIntv = 0）を持っていないブロックのみとなります。したがって、このメソッドは、光活性化のスキャンに続いて1ベースラインスキャンで始まります。ブロックの残りの部分は、900秒BkIntvを持っており、各時点でタイミングの一貫性を維持するためにだけ一度に2つのスキャンが0秒、があります。 時間の経過後にされる10個の細胞のそれぞれについて、このシーケンスを実行します。 表現するPAGFP見つけるのイメージング法をセルを保存する場所パネルのマークステージ位置は、撮像方法を指定主なROIパネルを選択し、特定のROIをパネルに保存し、またROIボックスにそれを読み込む光活性化ブリーチように関心領域を： ROIを消去し、1スキャンズームをリセット次のセルを見つけるとズームを設定次の9セルのためのプロセスを繰り返します。 各ステージの場所とすべてのブロックが関連付けられている適切な撮像法（スキャン設定）を持っていることを確認してください。また、残りは "モック"メソッドが含まれていながら、それぞれの場所で最初のブロックは、適切な光活性化法に対応していることを確認してください。最後に、 "実行"を選択してください。 5。 PA-GFPシグナル強度を解析する<li>の光活性化GFP-信号が赤TMRE信号に局在している細胞については、PAGFP画像（ここではmetamorphを使用します）のバックグラウンドを減算します。 その後、データをExcelにエクスポートし、各時点で、Z-スタックの平均強度を計算します。無信号を持たない光学切片を破棄します。 オリジナルの光活性化信号の割合を計算することによって、各Z-スタック内の信号の希釈を測定します。 各データポイントは、各時点の重複Z-スタック情報、その結果、2回スキャンされ、記録されます。 Z-スタックの値が一致していることを確認してください。そうでない場合は、これは問題（例えば、フォーカス、細胞運動）の指標である。 6。代表的な結果融合イベントが活性化および非活性化されたPA-GFPミトコンドリアの間で発生した場合には、ミトコンドリアのマトリックス内PAGFPは、非標識マトリックスと混合し、より大きな領域の上に希釈してなり、信号を減少させる強度（ 図1A）。ミトコンドリア融合の平衡に達するまで、INS1細胞では、信号強度の有意な減少は、（約1時間）、15分ごとに発生します。 図1Bのセルでは、PA-GFPとTMRE信号のほぼ完全な局在を示すことに注意してください。これらのアッセイでTMREの非常に低濃度（15 nM）をPAGFPの光活性化を標的とするための、また、細胞の健康を監視するために使用されています。脱分極ミトコンドリアが豊富な細胞がPAGFPとTMREの不完全な局在があります、これは死にかけている状態で、光毒性、または細胞のいずれかを示しているため、分析すべきではありません。 ミトコンドリアの融合のための平衡時間は、通常、ミトコンドリアの体積の約15％がアクティブになっているINS1細胞における1時間です。時には、小さな領域が点灯している場合であっても、ミトコンドリアのほとんどは、さらなる融合を検出することは困難である場合には、高度にネットワーク化されているために光活性化になる。他の細胞型は、異なる平衡化時間を示すことが、ミトコンドリアのダイナミクスを特徴づけるために短い間隔で、長い期間にわたってテストする必要があります。ミトコンドリアの融合を阻害するために、細胞をlipotoxic環境内に配置することができます。それは以前に0.4 mMのは、断片はミトコンドリアパルミチン酸、及びミトコンドリアの融合9を阻害することが実証されている。この効果は、ミトコンドリアが断片化され、 図2に見られることができますが、mtPAGFPの信号強度は、通常の条件（ 図1）の下でできるだけ変更されません。したがって、PA-GFPシグナルの希釈は、ミトコンドリアの融合ではなく、核分裂によるものである可能性があります。他の細胞タイプでは、我々はこのようなミトコンドリアの融合14が必要であるOPA1を黙らせるようにミトコンドリアの断片化を誘導する他の既知の方法を使用して、お勧めします。 図1。 </stroNG>ミトコンドリア融合アッセイ中の光活性化後のPA-GFP信号の典型的な希釈。A. PA-GFPは、徐々に暗くこれらの投影画像に見られるように増加する領域の上にタンパク質の希釈につながるミトコンドリアの融合イベントのためになります15分ごとに定量化6光のセクション。PA-GFPとB. TMREは、ミトコンドリア脱分極アクティブではないことを示しています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図2ミトコンドリア融合が0.4mMのパルミチン酸で阻害は、PA-GFPの希釈を減少させます。時間の経過とともに変化しない信号強度で短いミトコンドリアを示す6光学切片のA.投影 。TMREとPA-GFPのBの局在はミトコンドリアではないことを示していますド偏光。 拡大図を見るにはここをクリック 。

Discussion

買収は、光活性化後、15分ごとに発生した場合、このメソッドは、一度におよそ10細胞のイメージングを可能にします。細胞の正確な数は1つがどのように迅速に培養皿内でmtPAGFP発現する細胞を見つけて、マークすることができ、どのように迅速に1つのすべてのソフトウェアのパラメータを設定することができますによって異なります。指定されたZ-スタックマージンはすべてのセルに対して適用されるので自動化がスムーズに実行できるように細胞の均一な層を使用する必要があります。

この初期の光活性化領域のサイズは、平衡時間を制御します。ミトコンドリアの融合を測定することができるようにするには、それが残りのネットワークへの信号の広がりは経時的にモニターすることができるようなネットワークの唯一の10-20％、光活性化することが重要である。ネットワークのあまりに多くが光活性化されている場合は、それは完全な融合が速すぎると発生する可能性があり、イベントがキャプチャされません。

細心の注意を払う必要があり二光子レーザーのレーザパワーだけでなく、ミトコンドリアの脱分極を引き起こす毒性を避けるためにTMRE濃度を調整します。 mtPAGFP信号はTMRE信号と共局在することを保証することは、毒性と一般的な細胞の健康^8,15を評価^するのに役立ちます。 epifluoerescent光照射は避けるべきである。 mtPAGFPを発現する細胞を捜している間、低消費電力488nmの励起でスキャンしながら、ピンホールを最大限に開いている必要があります。 PA-GFPは1時間かけて信号を測定することではなく、セルのいずれかが⁸トリッキーなことができoversaturateないように十分な光活性化するために2つの光子レーザパワーを調整します。一度自動化されたプログラムが開始されたしかし、時間は、この最適化のステップに費やさなければならない、それは複数のセルを選択するには、それを停止し、再開するのは面倒です。

品質管理のため、微分干渉コントラスト（DIC）の買収は、セルにフォーカスを監視するための画像（または透過光）は非常にすることができます親切にも、スキャン中に浸油に形成された気泡を検出するための良い方法、これは時々ステージの動きから発生します。

このmtPAGFPメソッドを使用すると、ラベルが付いていないされているものに光活性化ミトコンドリアからのミトコンドリアのマトリックスタンパク質の単方向の動きにデータを収集しますが、それは他のプロセスを研究するためにこのテクニックを利用することが考えられる。の融合は、可溶性マトリックスタンパク質¹⁵の混合とは異なる時間スケールで発生し、ABC-私のために示されているようにたとえば、特定の蛍光色素は、核融合イベント時に、その特定の動きを観察し、膜タンパク質に結合することができます。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Zeiss