병렬 공촛점 현미경을 사용하여 여러 세포의 운동 데이터를 취득 빠르고 높은 해상도, mtPA-GFP 기반 Mitochondrial 퓨전 분석

Summary

Mitochondrial 융합은 시간이 지남에 mitochondrial 네트워크 photoconverted 매트릭스 타겟 GFP의 평균 추적에 의해 측정되었다. 지금까지 하나의 세포는 한 번에 한 시간 동안 운동 분석을 받다 수 있습니다. 우리는 동시에이를 통해 데이터 수집 과정을 속도, 여러 개의 세포를 측정하는 방법을 제시한다.

Abstract

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.

Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis^1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks^4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function¹⁸. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust¹⁴. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis⁹. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.

Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay⁷, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay^1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process ^4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.

A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)^6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal⁶. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE^9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.

The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity^8,15,16,17.

In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE⁸ in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO₂, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Protocol

1. 이미지 플레이트 준비 10% 표준 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 – 스트렙토 마이신, 2 개의 MM L-글루타민, 50 μm의 2 – 메르 캅 토 에탄올, 5 밀리미터 NaHCO 3, 2 MM HEPES, 2 개의 MM pyruvic 산성, 11 MM 포도당을 포함하는 RPMI 미디어 문화 INS1 세포 80 % 합류합니다. 0.05 %의 트립신 및 플레이트 그들 폴리-D-라이신 코팅 coverslip 바닥 이미징 플레이트 (30~40%의 합류점)를 향해 함께 INS1 셀 문화를 Trypsinize. 번호판 60~80%의 합류점 (~ 2 일)에 도달하고 mitochondrial 매트릭스는 타겟 추가할 수 있도록 허용 (COXVIII)에 대한 adenoviral PA-GFP 24 시간 (방어 = 5). 교환 매체와 세포 이미징하기 전에 다른 2 일 성장할 수 있습니다. 이미징의 날, 이미징 플레이트로 7-15 나노미터 TMRE을 추가하고 적어도 45 분 동안 평형. 인큐베이터에서이 시간 순서 (무대 최고 인큐베이터 여기에 사용되고있다) 동안과 현미경 ° C에서 약 1 시간 동안 37 평형 수 있습니다. 5 % CO 2를 켭니다. </리> 2. 자이스 혈구 LSM 710 공촛점 현미경을위한 이미징 매개 변수 현미경 equilibrated 후 취득 탭 아래, "쇼 설명서 도구"를 클릭 이미징이 패널을 설치 열고 "채널 모드"를 선택하고 모든 "프레임"을 추적할 전환합니다. 라이트 경로 패널에서 LSM 및 채널 모드를 선택합니다. 표본 아이콘에서 일하는 것은 상향, 690 + 및 MBS 488 "리어", MBS를 선택합니다. 패널의 아래쪽에서 명시야 또는 DIC 채널의 시각화을 활성화하는 "T-PMT"를 선택합니다. 490-540 nm의와 TMRE 색소를위한 580-700 nm의에 GFP의 염료에 대한 범위를 설정하여 빛의 경로 매개 변수를 조정 완료. 획득 모드에서 × 512 픽셀 스캔 필드, 평균 4X를 512을 사용하고 줌 계수를 (당신이 교정 목적으로 일관성있게 유지하려는 수도 있음)를 선택합니다. 3. 이미징 매개 변수를 최적화 foc는 (1.4 NA) 100x 객관 렌즈를 계획 고차 색지움 사용phototoxicity에서 mitochondria 보호하는 할로겐 라이트가 아닌 형광등, 귀하의 세포에있는 우리. PA-GFP는 maximally 오픈 핀홀을 사용하여 세포를 표현하고 밝은 녹색 세포를 찾기 위해 스캔을위한 화면. PA-GFP를 활성화하고 신호가 감지기를 포화하지 않는다는 보장 이미징 매개 변수를 최적화하는 데 필요한 2 광자 레이저의 가장 낮은 전력을 찾습니다. PA-GFP 신호가 몇 Z-시리즈 TMRE 신호 colocalizes 확인하십시오. TMRE 신호의 손실은 mitochondrial 탈분극 또는 phototoxicity을 표시하고, 세포는 이러한 특성을 분석에 사용하지 않아야 전시. PA-GFP 표현하는 셀을 찾아 줌 계수를 지정합니다. 6 조각 (특정 Z-포커스가 각 위치에서 설정하지 않는 한이 범위 모두 10 세포를 충족해야합니다)를 수집하기 위해 Z-시리즈 범위를 설정합니다. 각 셀 (셀 1, 셀 2 등)에 이미징 방법을 저장합니다. 4. 자동화 조정D 프로그램의 부분 그리고 당신이 1 시간 Mitochondrial 퓨전 분석을 위해 따르는 10 개의 셀을 지정 multitime 창의 왼쪽 패널에서 "절약"패널을 선택하고 파일이 저장됩니다 위치를 지정합니다. "취득"패널에서 스캔 구성 세포 1 저장한 수집 방법을로드하고 Z 스택 상자를 선택합니다. 또한 "Z 스택의 Z-한가운데 표시"를 선택합니다. "블록"패널에서 "각각의 장소에서 하나의 블록"를 선택합니다. 측정되는 각 구간에 대해 "추가 블록"을 클릭합니다. "타이밍"패널에서 "처음 위치로만에 차단하기 전에 대기 간격"에서 "간격을 기다"및 유형 "0"를 선택합니다. 블록 2-4이 섹션에서 "15 분"을해야합니다. 장소 패널에서 선택 "위치 사이의 위치를​​로드하는 데 초점을 이동"및 다중 "을 선택 후와"모두를 지우 편집 위치 목록 "을 선택" "로드 또는 '다음 LOC의'클릭 '은 LOC로 이동'때 아래. 설정 검색" 위치는 "무대를 동력. 깨물어어 "블리치"패널은 "표백제"상자를 클릭하고 "설정"에서 설정 파일을 지정 메뉴를 풀다운 등 주요 소프트웨어의 윈도우에 지정. 그런 다음 "표백"창에서 적절한 photoactivati​​on 방법을 저장합니다. 지역 패널에서이 특정 세포에 대한 투자 수익 (ROI)를 선택하고, 윈도우 '투자 수익 (ROI) 목록에 추가할 현재 영역 "을 선택하여 multitime이 투자 수익 (ROI)을 추가합니다. 풀다운 메뉴를 '투자 수익 (ROI) "에서 같은 위치를 선택하십시오. 타이밍이 제대로 작동하기 위해서는 각각의 세포는 15 분 간격을해야하는 두 가지 방법 저장해야합니다. 블록의 목록에서, 첫번째는 "진짜"photoactivati​​on 구성을 가지게 될 것이며, 나머지 두 광자 레이저를 사용하지 않는 "모의"구성을해야합니다. 첫 번째 블록도 (= 0 BKIntv) 지연이없는 유일한 블록 될 것입니다. 따라서 방법은 photoactivati​​on 스캔 다음에 한베이스 라인 스캔과 함께 시작됩니다. 블록의 나머지 900 초 BkIntv를 가지고 있고,각 시점에서 타이밍의 일관성을 유지하는 것처럼 시간 0 초 두 검사가 마련되어 있습니다. 시간이 지남에 따라되는 10 세포의 각각의 경우이 시퀀스를 수행합니다 : 표현 PAGFP 찾기 자사의 이미징 방법으로 세포를 저장 위치는 무대 위치를 패널 표시, 이미징 방법을 지정 주요 투자 수익 (ROI) 패널을 선택 구체적인 투자 수익 (ROI)을 패널 저장하고 또한 투자 수익 (ROI)을 상자에 넣어로드 photoactivated 블리치로 관심 지역 : 투자 수익 (ROI)을 지우고 1로 스캔 확대를 재설정 다음 셀을 찾아 줌으로 설정 다음 9 세포에 대한 과정을 반복 각 단계의 위치와 모든 블록 관련된 적절한 이미징 방법 (스캔 구성)가 있는지 확인합니다. 또한, 나머지는 "모의"방법을 포함하면서 각 위치에서 첫 번째 블록은 적절한 photoactivati​​on 메서드에 해당하는지 확인하십시오. 마지막으로, "실행"을 선택하십시오. 5. PA-GFP 신호 강도를 분석 <lI> photoactivatable-GFP 신호가 빨간색 TMRE 신호로 colocalizes있는 세포의 경우 PAGFP 이미지 (여기서 우리가 metamorph을 사용)의 배경을 뺍니다. 그런 다음 엑셀로 데이터를 내보낼하고 각 시점에서 Z-스택에 대한 평균 강도를 계산합니다. 신호가없는 광학 부분을 폐기하십시오. 원래 photoactivated 신호의 비율을 계산하여 각 Z-스택의 신호 희석을 측정합니다. 각 데이터 포인트는 각 시점에 대한 중복 Z-스택 정보를 그 결과 두 번 스캔되어 기록됩니다. Z-스택 값을 동의 확인하십시오. 그렇지 않다면,이 문제 (예 : 초점, 세포 운동)을 나타내는 것입니다. 6. 대표 결과 융합 이벤트가 활성 및 비 활성 PA-GFP mitochondrion 사이에 발생하면 mitochondrial 매트릭스 내에서 PAGFP가 아닌 라벨이 매트릭스와 혼합하고 큰 지역에 희석되고, 신호를 감소강도 (그림 1A). mitochondrial 융합의 평균이 (약 1 시간)에 도달되기 전에 INS1 세포에서 신호 강도가 크게 감소는 15 분 간격으로 발생합니다. 그림 1B의 세포 PA-GFP 및 TMRE 신호의 거의 완전한 colocalization을 전시하고 있습니다. 이러한 assays에서 TMRE의 매우 낮은 농도 (15 NM) PAGFP의 photoactivati​​on을 타겟팅하기 위해, 또한 세포의 건강을 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 중 phototoxicity, 또는 죽어가는 상태의 세포를 원하셨기에 depolarized mitochondria의 풍부한 세포는 PAGFP 및 TMRE의 불완전한 colocalization을 주어 분석해서는 안됩니다. ~ mitochondrial 볼륨의 15 %가 활성화될 때 mitochondrial 융합을위한 평균 시간은, 보통 INS1 세포에서 1 시간입니다. 때로는 작은 면적가 켜져있는 경우에도 mitochondria 대부분 인해 더욱 융합 감지하기 어려운 경우에는 높은, 네트워크받는 것에 photoactivated되기. 다른 세포 유형은 서로 다른 평균 시간을 나타내는 수 있고 mitochondrial 역학 성격 짧은 간격과 긴 기간 동안 테스트해야합니다. mitochondrial 융합을 억제하기 위해 세포 lipotoxic 환경에서 배치될 수 있습니다. 그것은 이전에 0.4 MM은 파편이 mitochondria palmitate 것을 입증하고, mitochondrial 융합 9 억제되었습니다. 이 효과는 mitochondria가 조각되어 그림 2에서 볼 수 있지만, mtPAGFP의 신호 강도가 정상 상태 (그림 1)에서만큼 변경되지 않습니다. 따라서 PA-GFP 신호의 희석 오히려 분열보다 mitochondrial 융합으로 인해가 될 가능성이 높습니다. 다른 세포 유형에서 우리는 그러한 mitochondrial 퓨전 14 필요한 OPA1 입을 등 mitochondrial 분열을 유도하기 위해 알려진 다른 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 1 그림. </stroNG> mitochondrial 융합 분석 중에 photoactivation 후 PA-GFP 신호의 일반적인 희석. A. PA-GFP는 점차적으로 주차이 투사된 이미지에서 볼 수 있듯이 증가 면적 이상의 단백질의 희석에 이르는 mitochondrial 퓨전 이벤트로 인해됩니다 6 광학 섹션은 15 분 간격으로 계량의. PA-GFP와 B. TMRE는 mitochondria가 depolarized 활성화되어 있지 않다는 것을 보여줍니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 . . Mitochondrial 융합은 0.4 밀리미터 palmitate와 저해 그림 2 PA-GFP의 희석을 감소시킵니다. 시간이 지남에 변함없는 신호 강도와 짧은 mitochondria를 보여주는 6 광학 섹션 A. 추정치. TMRE와 PA-GFP의 바실러스 Colocalization 그 mitochondria가 없습니다 보여줍니다 드편광. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

Discussion

인수 photoactivati​​on 후 15 분마다 발생하는 경우이 방법은 한 번에 약 10 세포 이미징을 허용합니다. 세포의 정확한 숫자는 하나 mtPAGFP 표현 문화 접시 내에서 세포, 그리고 얼마나 빨리 하나가 모든 소프트웨어 매개 변수를 설정할 수를 찾아 표시할 수있게하는 속도에 따라 다릅니다. 지정된 Z-스택 마진은 모든 세포를 신청하기 때문에 자동화가 원활하게 실행하기 위해서 세포의도 레이어를 사용해야합니다.

이 초기 photoactivati​​on 영역의 크기는 평균 시간을 적용합니다. mitochondrial 융합을 측정할 수있게하기 위해서는 네트워크의 나머지 부분에 대한 신호의 확산은 시간이 지남에 따라 모니터링할 수 있도록 네트워크의 유일한 10~20%를 photoactivate하는 것이 중요합니다. 네트워크의 너무 많이가 photoactivated 경우, 그것은 완전한 융합도 빠르게 발생 가능성이 있으며, 이벤트가 캡처되지 않습니다.

익스 트림주의로 이동합니다두 광자 레이저의 레이저 파워뿐만 아니라 mitochondrial 탈분극로 연결 phototoxicity을 피하기 위해 TMRE 농도를 조정합니다. mtPAGFP 신호가 TMRE 신호로 colocalizes 수 있도록하는 것은 phototoxicity과 일반 세포 건강 ^8,15를 평가하는 데 유용합니다. epifluoerescent 빛이있는 조명은 피해야한다. mtPAGFP을 표현 세포를 검색하는 동안 저전력 488nm의 여기로 스캔하는 동안, 핀홀이 maximally 열려 있어야합니다. PA-GFP는 1 시간 이상 신호를 측정할 수 있지만 세포 중 ⁸ 까다롭습 수 oversaturate하는 데 충분하지 photoactivate하는 두 광자 레이저 파워 조절. 일단 자동으로 프로그램이 시작되기 때문에 그러나 시간이 최적화 단계에서 지출되어야합니다 그것은 세포를 선택하여, 그것을 중지하고 재개하는 지루한이다.

품질 관리의 경우 차등 간섭 대비 (DIC)의 인수 세포에 초점을 모니터 이미지 (또는 전송 빛) 매우 될 수 있습니다도움이 또한 스캔하는 동안 침지 기름에 형성된 거품을 감지하는 좋은 방법, 이것은 때로는 무대의 움직임에서 발생합니다.

이 mtPAGFP 방법을 사용하면 분류되지 않은 사람들에게 photoactivated mitochondria에서 mitochondrial 매트릭스 단백질의 단방향 운동에서 데이터를 수집하지만, 그것은 다른 프로세스를 연구하기 위해이 기술을 활용하는 생각할 수있다. 예를 들어, 특정 fluorochromes는 ABC-날 ¹⁵ 가용성 매트릭스 단백질의 혼합에서 다른 시간 척도에서 발생하는의 융합에 표시되었습니다대로 퓨전 이벤트 기간 동안 자신의 구체적인 움직임을 관찰하는 멤브레인 단백질에 첨부하실 수 있습니다.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Zeiss