En raskere, High Resolution, mtpa-GFP-baserte Mitokondrie Fusion Assay Innhente Kinetic Data om flere celler i parallell Bruke konfokalmikroskopi

Summary

Mitokondrie fusjon ble målt ved å spore ekvilibrering av photoconverted matrix-målrettet GFP over mitokondrie nettverket over tid. Så langt, kunne bare en celle må utsettes for en times lang kinetisk analyse av gangen. Vi presenterer en metode som samtidig måler flere celler, og dermed påskynde datainnsamlingen.

Abstract

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.

Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis^1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks^4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function¹⁸. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust¹⁴. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis⁹. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.

Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay⁷, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay^1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process ^4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.

A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)^6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal⁶. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE^9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.

The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity^8,15,16,17.

In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE⁸ in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO₂, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Protocol

1. Bilde Plate Forberedelse Kultur INS1 celler i RPMI medier som inneholder 10% standard fosterets bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, 2 mm L-glutamin, 50 mM 2-mercaptoethanol, 5 mm NaHCO 3, 2 mm HEPES, 2 mm pyruvic syre, og 11 mm glukose til 80% samløpet. Trypsinize de INS1 cellekulturer med 0,05% trypsin og plate dem på poly-D-lysin belagte dekkglass bunn bildebehandling plater (30-40% samløpet). Tillat for plater til nå 60-80% samløpet (~ 2 dager) og legge mitokondriematrix målrettet (COXVIII) adenoviral PA-GFP for 24 timer (MOI = 5). Utveksle media og tillate celler til å vokse ytterligere 2 dager før bildebehandling. På dagen for bildebehandling, legger 7-15 nM TMRE til bildebehandling platene, og stabilisering i minst 45 min. I løpet av denne tiden sving på inkubatoren (stadium topp inkubatoren har vært brukt her) og la mikroskop for å stabilisere til 37 ° C i ca 1 time. Slå på 5% CO 2. </li> 2. Imaging Parametere for Zeiss LSM 710 confocal mikroskop Etter mikroskopet har likevekt, under Acquisition kategorien Klikk på "Vis manuelle verktøy", åpner bildebehandling satt opp panel, og velg "kanal mode" og bytte spore hver "frame". I lys sti panelet, velger LSM og kanal modus. Arbeide fra prøven ikonet oppover, velg "bak", MBS 690 + og MBS 488. På bunnen av panelet, velg "T-PMT" for å aktivere visualisering av den lyse felt eller DIC kanal. Fullfør justere lysbanen parametere ved å angi området for GFP fargestoff til 490-540 nm og 580-700 nm for TMRE fargestoff. I oppkjøpet modus bruker en 512 × 512 piksler skanning feltet, gjennomsnittlig 4x, og velger en zoom faktor (som du kanskje ønsker å beholde konsekvent for kalibrering). 3. Optimalisere Imaging Parametere Bruke planen apochromat 100x (1,4 NA) objektiv, focoss på dine celler med halogen lys, ikke fluorescerende lys, for å beskytte mitokondriene fra fototoksisitet. Screen for PA-GFP uttrykke celler ved hjelp av en maksimalt åpen pinhole og skanning for å finne de cellene som er lysere grønt. Finn laveste kraft to-foton laser for å aktivere PA-GFP og optimalisere tenkelig parametre som sikrer at signalet ikke mette detektoren. Sjekk at PA-GFP signal colocalizes med TMRE signal for noen z-serien. Tap av TMRE signal indikerer mitokondrie depolarization eller fototoksisitet, og cellene utviser disse egenskapene bør ikke brukes for analyse. Finn en PA-GFP uttrykke celle og angi en zoomfaktor. Angi z-serien rekkevidde å samle 6 skiver (dette området må tilfredsstille alle 10 celler med mindre en bestemt z-fokus er satt på hver posisjon). Lagre bildebehandling metoden for hver celle (celle 1, celle 2 osv.). 4. Juster Automatiserd delen av programmet og utpeke de 10 cellene du vil følge for en time Mitokondriemyopati Fusion Assay På venstre panel i multitime vinduet, velg "lagre"-panelet, og angi hvor filene skal lagres. I "Acquisition" panel, laste oppkjøpsmetoden spart for celle 1 i skanningen konfigurasjon og sjekk z stabelen boksen. Også velge "merket Z-midten av z stack". I "blokker" panel, velg "enkelt blokk på hvert sted". Klikk på "Legg blokker" for hvert intervall skal måles. I "timing" panel, velg "vente intervall" og skriv "0" i "ventetiden før til blokk på første sted bare". Blokkerer 2-4 vil ha "15 min" i denne delen. I stedet panelet, velg "flytte fokus for å laste posisjon mellom steder" og "last skanne config når 'flytter til loc" eller "neste loc" klikket. Under "Rediger steder liste" velger du "tømme alle" og deretter velge "multiple steder motorisert scenen ". UndAkutten på "Bleach" panel, klikk på "Bleach" boksen, og utpeke konfigurasjonsfilen i "config" nedtrekksmenyen, som angitt i vinduet av de viktigste programvaren. Deretter, i "bleking"-vinduet, lagre den aktuelle photoactivation metoden. I regionene panelet, velger ROI for denne cellen, og legge denne avkastningen til multitime ved å velge "Legg til gjeldende region til ROI liste"-vinduet. Pass på å velge samme sted i "avkastningen" nedtrekksmenyen. For timingen skal fungere og for hver celle å ha en 15 minutters intervall, to metoder må bli frelst. I listen over blokker, vil den første ha "ekte" photoactivation konfigurasjon, og resten vil ha en "mock"-konfigurasjon som ikke bruker to-foton laser. Den første blokken vil også være den eneste blokk som ikke har en forsinkelse (BKIntv = 0). Derfor begynner metoden med en baseline skanning, etterfulgt av en photoactivation scan. Resten av blokkene har en 900 sek BkIntv, ogpå hvert tidspunkt er det to skanninger like ved tidspunkt 0 sek, for å opprettholde timing konsistens. For hver av de 10 cellene som skal følges over tid, utføre denne sekvensen: Finn en PAGFP uttrykke celle-redde sin bildebehandling metode Sted panel-merke scenen posisjon, angir avbildning metode Hoved ROI panel-velge en region av interesse å være photoactivated Bleach panel-lagre spesifikk ROI og også legge det i ROI-boksen: Slette ROI og tilbakestille skanning zoom til 1 Finn den neste cellen, og angi zoom Gjenta prosessen for de neste 9 celler Kontroller at hver fase plassering og alle blokkene har riktig bildebehandling metoden (skanning konfigurasjon) tilknyttet. Pass også på at den første blokken på hvert sted tilsvarer den aktuelle photoactivation metoden mens resten inneholde en "mock"-metoden. Til slutt, velg "kjør". 5. Analyser PA-GFP Signal Intensity <li> For de cellene der photoactivatable-GFP signal colocalizes med den røde TMRE signal, trekker bakgrunnen i PAGFP bildene (her bruker vi metamorph). Deretter eksportere data til Excel og beregne gjennomsnittlig intensitet for z-klippene på hvert tidspunkt. Kast optiske seksjoner som ikke har signal. Mål signalet fortynning i hvert z-stack ved å beregne hvor stor prosentandel av den opprinnelige photoactivated signalet. Hvert datapunkt er skannet og registrert to ganger, noe som resulterer i duplikat z-stack for hvert tidspunkt. Kontroller at z-stack verdier enig. Hvis ikke, dette er en indikasjon på et problem (f.eks fokus, celle bevegelse). 6. Representative Resultater Når en fusjon hendelse oppstår mellom en aktivert og ikke-aktivt PA-GFP mitokondrie, blander PAGFP innenfor mitokondriematrix med ikke-merket matrise og blir fortynnet over et større område, redusere signalintensitet (Figur 1A). I INS1 cellen, oppstår en betydelig nedgang i signal intensitet hvert 15. minutt, inntil likevekt av mitokondriell fusion er nådd (ca. 1 time). Merk at cellen i figur 1B viser nesten komplett colocalization av PA-GFP og TMRE signaler. I disse analysene en svært lav konsentrasjon av TMRE (15 nM) brukes til å målrette den photoactivation av PAGFP, og også for å overvåke celle helse. Celler med en overflod av depolarized mitokondriene vil ha ufullstendig colocalization av PAGFP og TMRE og bør ikke bli analysert fordi dette indikerer enten fototoksisitet, eller celler i en døende tilstand. Den ekvilibrering tid for mitokondrie fusjon er som regel en time i INS1 celler, da ~ 15% av mitokondrie volumet er aktivert. Noen ganger, selv om et lite område lyser, de fleste av mitokondrier blir photoactivated grunn til å være svært nettverk, i så fall ytterligere fusjon er vanskelig å oppdage. Andre celletyper kan utvise forskjellige ekvilibrering tider og bør testes med kortere intervaller og over en lengre periode for å karakterisere mitokondrielle dynamikk. Å hemme mitokondrie fusjon, kan cellene plasseres innenfor en lipotoxic miljø. Det har tidligere blitt vist at 0,4 mm palmitate fragmenter mitokondrier, og hemmer mitokondrienes fusjon 9. Denne effekten kan sees i figur 2, hvor mitokondriene er fragmentert, men signalet intensiteten av mtPAGFP ikke endres så mye som under normale forhold (Figur 1). Derfor er det fortynning av PA-GFP signal sannsynligvis skyldes mitochondrial fusion snarere enn fisjon. I andre celler typer, foreslår vi at du bruker andre kjente måter å indusere mitochondrial fragmentering, som for eksempel stanse OPA1 som er nødvendig for mitochondrial fusion 14. Figur 1. </strong> Typisk fortynning av PA-GFP signal etter photoactivation under en mitochondrial fusjon analysen. A. PA-GFP blir gradvis dimmer pga mitokondrielle fusion hendelser som fører til utvanning av protein over et økende område som kan bli sett i disse projiserte bilder 6 optiske seksjoner kvantifisert hvert 15. minutt. B. TMRE med PA-GFP viser at mitokondriene er aktive og ikke depolarized. Klikk her for å se større figur . Figur 2. Mitokondrie fusjon hemmet med 0,4 mm palmitate reduserer fortynning av PA-GFP. A. Framskrivinger av 6 optiske seksjoner som viser kort mitokondrier med en uforanderlig signal intensitet over tid. B. Colocalization av PA-GFP med TMRE viser at mitokondriene ikke depolarisert. Klikk her for å se større figur .

Discussion

Denne metoden gir mulighet for avbildning av rundt 10 celler på en gang, hvis oppkjøpet skjer hvert 15. minutt etter photoactivation. Det nøyaktige antall celler vil avhenge av hvor raskt man er i stand til å lokalisere og markere de mtPAGFP uttrykker cellene i kultur parabolen, og hvor raskt man kan sette opp alle de programvare parametere. For å gjøre automatisering fungere smertefritt et jevnt lag av celler bør brukes fordi de utpekte z-stack marginer vil gjelde for alle celler.

Størrelsen på denne første photoactivation området vil styre ekvilibrering tid. For å kunne måle mitokondrielle fusion, er det viktig å photoactivate bare 10-20% av nettet, slik at spredning av signalet til resten av nettverket kan overvåkes over tid. Hvis for mye av nettverket er photoactivated, er det mulig at fullstendig fusjon vil skje for raskt, og arrangementet vil ikke bli fanget opp.

Ekstrem forsiktighet må tas for åjustere laser makt av de to-foton laser samt TMRE konsentrasjon for å unngå fototoksisitet som fører til mitochondrial depolarization. Sikre at mtPAGFP signalet colocalizes med TMRE signal kan hjelpe i vurderingen fototoksisitet og generell celle helse ^8,15. Illumination med epifluoerescent lys bør unngås. Mens du søker etter celler uttrykker mtPAGFP bør pinhole være maksimalt åpen mens du skanner med en lav effekt 488nm eksitasjon. Justere to-foton laser makt til photoactivate nok PA-GFP å måle signal over en time, men ikke til oversaturate noen av cellene kan være vanskelig ^åtte. Imidlertid bør tiden bli brukt i denne optimaliseringen trinnet fordi når automatisert program er startet, er det kjedelig å stoppe det, å velge flere celler, og gjenoppta.

For kvalitetskontroll, oppkjøp av en differensial interferens kontrast (DIC) bilde (eller overføres lys) for å overvåke fokus på cellene kan være sværtnyttig og også en god måte å oppdage bobler dannes i immersjonsolje under skanning, dette skjer noen ganger fra bevegelser på scenen.

Selv om du bruker denne mtPAGFP metoden samler data om enveis bevegelse mitokondriematrix proteiner fra photoactivated mitokondriene til de som ikke er merket, er det tenkelig å benytte denne teknikken til å studere andre prosesser. For eksempel kan konkrete fluorokromer festes til membran proteiner for å observere deres spesifikke bevegelser under fusion arrangementer, som har blitt vist for ABC-meg, sammensmeltingen som skjer på et annet tidspunkt skala fra en blanding av løselige matrix proteiner ^15.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Zeiss