Una más rápida, de alta resolución, APMt-GFP-ensayo basado en la fusión mitocondrial Adquisición de datos cinéticos de varias celdas en paralelo mediante microscopía confocal

Summary

Fusión mitocondrial se midió mediante el seguimiento de la equilibración de photoconverted matriz orientada GFP través de la red mitocondrial en el tiempo. Hasta ahora, sólo una célula podría ser sometido a un análisis cinético hora larga a la vez. Se presenta un método que mide simultáneamente varias celdas, y acelera así el proceso de recopilación de datos.

Abstract

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.

Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis^1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks^4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function¹⁸. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust¹⁴. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis⁹. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.

Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay⁷, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay^1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process ^4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.

A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)^6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal⁶. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE^9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.

The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity^8,15,16,17.

In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE⁸ in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO₂, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Protocol

1. Imagen de preparación de la placa Cultura INS1 células en RPMI medios que contienen 10% de suero fetal bovino estándar, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 50 mM 2-mercaptoetanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM de HEPES, 2 mM de ácido pirúvico, y 11 mM de glucosa a 80% de confluencia. Trypsinize los cultivos celulares INS1 con 0,05% de tripsina y la placa de ellos en poli-D-lisina placas recubiertas de imagen de fondo (cubreobjetos% de confluencia 30-40). Permita que las placas para llegar a 60-80% de confluencia (~ 2 días) y añadir matriz mitocondrial específica (COXVIII) adenoviral PA-GFP durante 24 horas (MOI = 5). Cambio de los medios de comunicación y permiten a las células a crecer durante otros 2 días antes de la imagen. En el día de formación de imágenes, añadir 7-15 TMRE nM a las placas de imagen, y equilibrar durante al menos 45 minutos. Durante este tiempo su vez en la incubadora (fase superior incubadora se ha utilizado aquí) y permitir que el microscopio se equilibre a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora. Encienda el 5% de CO 2. </li> 2. Los parámetros de imagen para el Zeiss LSM 710 Microscopio Confocal Después de que el microscopio tiene equilibrada, en la pestaña de adquisición, haga clic en "Mostrar herramientas manuales", abra la imagen creada del panel, y seleccione "modo de canal" y cambiar el seguimiento de cada "cuadro". En el panel de trayectoria de la luz, elija LSM y el modo de canal. Trabajo desde el icono de la muestra hacia arriba, seleccione "Trasero", MBS 690 +, y MBS 488. En la parte inferior del panel, elige "T-PMT" para permitir la visualización del campo brillante o canal DIC. Terminar de ajustar los parámetros de ruta de acceso de luz mediante el establecimiento de la gama para el tinte de las buenas prácticas agrarias de 490-540 nm y 580-700 nm para el tinte TMRE. En el modo de adquisición, el uso de 512 × 512 píxeles de exploración de campo, 4x promedio, y elegir un factor de zoom (que usted puede desear para mantener constante para fines de calibración). 3. Optimización de los parámetros de imagen Uso de la apocromático plan de 100x (1,4 NA) lente del objetivo, focnosotros en las células con la luz halógena no, la luz fluorescente, para proteger a la mitocondria de fototoxicidad. Pantalla para PA-GFP células que expresan con un agujero lo más abierto y escaneo para encontrar las células que son más brillantes de color verde. Buscar la menor potencia del láser de 2 fotones necesarios para activar el PA-GFP y optimizar los parámetros de imagen para garantizar que la señal no saturar el detector. Compruebe que la señal PA-GFP colocalizes con la señal de TMRE para unos pocos z-series. La pérdida de la señal TMRE indica despolarización mitocondrial o fototoxicidad, y las células exhibiendo estas características no debe ser utilizado para el análisis. Buscar una celda PA-GFP expresar y especificar un factor de zoom. Ajuste el rango de la serie Z para recoger 6 rebanadas (de este rango se necesitan para satisfacer todas las 10 celdas a menos que específica-z de enfoque se fija en cada posición). Guarde el método de imagen para cada celda (la celda 1, celda 2, etc.) 4. Ajuste el AutomatizarParte D del programa y designar a las 10 celdas que usted seguirá para el ensayo de fusión mitocondrial 1 Hora En el panel izquierdo de la ventana MultiTime, seleccione la opción "ahorro" del panel, y especifique la ubicación donde los archivos se guardarán. En la "Adquisición" del panel, cargar el método de adquisición salvo para la celda 1 en la configuración de escaneo y marca la casilla de pila z. Además, puede seleccionar "marca Z-media de la pila de z". En el "bloques" del panel, seleccione "solo bloque en cada lugar". Haga clic en "bloques" add para cada intervalo que debe medirse. En el "timing" del panel, seleccione "Intervalo de espera" y tipo "0" en el "intervalo de espera antes de bloque en la ubicación de sólo la primera". Bloques 2-4 tendrá "15 minutos" en esta sección. En el panel de ubicación, seleccione "mover el foco al cargar la posición entre los lugares" y "analizar la carga de configuración cuando se 'mueven a la loc' o hacer clic en 'siguiente loc'. En virtud de la" lista de lugares de edición ", seleccione" borrar todo "y luego seleccione" múltiples lugares motorizada etapa ". Under el "blanqueo" del panel, haga clic en el "blanqueo" y, a designar el archivo de configuración en la "configuración" del menú desplegable, según lo señalado en la ventana del programa principal. Luego, en el "blanqueamiento" de la ventana, sino el método de fotoactivación apropiado. En el panel de las regiones, elija el retorno de la inversión para esta célula en particular, y añadir este retorno de la inversión a la MultiTime por la elección "región actual añadir a la lista retorno de la inversión" de la ventana. Asegúrese de seleccionar el mismo lugar en el "retorno de la inversión" en el menú desplegable. Por el momento para que funcione correctamente y para que cada célula tiene un intervalo de 15 minutos, dos métodos necesitan ser salvados. En la lista de bloques, el primero tendrá la "real" de configuración de fotoactivación, y el resto tendrá un "simulacro" de configuración que no utiliza el láser de dos fotones. El primer bloque también será el único bloque que no tiene un retardo (BKIntv = 0). Por lo tanto, el método comienza con una exploración inicial, seguido por una exploración de fotoactivación. El resto de los bloques tienen un 900 seg BkIntv, yen cada momento hay dos exploraciones como en el tiempo 0 segundos, para mantener la consistencia de tiempo. Para cada una de las 10 celdas que deben seguirse a través del tiempo, lleve a cabo la siguiente secuencia: Encuentre un PAGFP célula que expresa-salvar su método de imagen Ubicación panel marcar la posición del portaobjetos, especificar el método de imagen Retorno de la inversión principal panel elija una región de interés para Bleach fotoactivado del panel de ahorro de retorno de la inversión específica y también carga en la caja de retorno de la inversión: Borrar el retorno de la inversión y restablecer el zoom de exploración a 1 Encuentra la celda de al lado y establecer el zoom Repita el proceso para los próximos 9 celdas Compruebe que cada lugar el escenario y todos los bloques tienen el método de imagen apropiado (la configuración de análisis) asociados. También asegúrese de que el primer bloque en cada ubicación se corresponde con el método de fotoactivación adecuada, mientras que el resto contiene un "simulacro" método. Finalmente, seleccione "Ejecutar". 5. Analizar la intensidad de señal PA-GFP <li> para las células en las que la señal de las buenas prácticas agrarias-fotoactivable colocalizes con la señal de TMRE rojo, restar el fondo en las imágenes PAGFP (aquí usamos MetaMorph). A continuación, exportar los datos a Excel y calcular la intensidad media de z-pilas en cada momento. Eliminar secciones ópticas que no tienen señal. Medir la dilución de la señal en cada z pila mediante el cálculo del porcentaje de la señal fotoactivada original. Cada punto de datos se escanea y se registró el doble, lo que resulta en duplicado z pila información para cada punto de tiempo. Compruebe que los valores de Z-Stack están de acuerdo. Si no, lo que es indicativo de un problema (atención por ejemplo, el movimiento celular). 6. Los resultados representativos Cuando una actividad de fusión se produce entre un activado y no activado-PA-GFP mitocondria, la PAGFP dentro de la matriz mitocondrial se mezcla con la matriz no marcada y se diluye en un área mayor, disminuyendo la señalintensidad (Figura 1A). En la celda INS1, una disminución significativa en la intensidad de la señal se produce cada 15 minutos, hasta que el equilibrio de fusión mitocondrial ha sido alcanzado (aproximadamente 1 hora). Tenga en cuenta que la celda en la Figura 1B muestra colocalización casi completa de la PA-GFP y señales TMRE. En estos ensayos una concentración muy baja de TMRE (15 nM) se utiliza para ayudar a orientar la fotoactivación de PAGFP, y también para controlar la salud celular. Las células con una gran cantidad de mitocondrias despolariza tendrá colocalización incompleta de PAGFP y TMRE y no debe ser analizada, porque esto indica fototoxicidad o células en un estado moribundo. El tiempo de equilibrio para la fusión mitocondrial es usualmente de 1 hora en INS1 células, cuando ~ 15% del volumen mitocondrial se activa. A veces, incluso si un área pequeña es iluminada, la mayoría de las mitocondrias se fotoactivados debido a ser altamente red, en cuyo caso la fusión adicional es difícil de detectar. Otros tipos de células pueden mostrar diferentes momentos de equilibrio y deben ser examinados a intervalos más cortos y más de un período más largo para caracterizar la dinámica de la mitocondria. Para inhibir la fusión mitocondrial, las células se pueden colocar dentro de un entorno lipotóxico. Previamente se ha demostrado que 0,4 mM palmitato fragmentos mitocondrias, e inhibe la fusión mitocondrial 9. Este efecto puede verse en la Figura 2, donde las mitocondrias están fragmentados, pero la intensidad de la señal de la mtPAGFP no cambia tanto como en condiciones normales (Figura 1). Por lo tanto, la dilución de la señal de PA-GFP es probable que sea debido a la fusión mitocondrial en lugar de fisión. En otros tipos de células, le sugerimos que utilice otras formas conocidas para inducir la fragmentación mitocondrial, como silenciar OPA1 que es necesario para la fusión mitocondrial 14. Figura 1. </strong> dilución Típica de la señal de PA-GFP después de la fotoactivación durante un ensayo de fusión mitocondrial. A. PA-GFP se vuelve progresivamente más tenue debido a eventos de fusión mitocondriales que conducen a la dilución de la proteína sobre un área creciente como puede verse en estas imágenes proyectadas de 6 secciones ópticas cuantificó cada 15 minutos. B. TMRE con PA-GFP muestra que las mitocondrias son activos y no despolariza. Haga clic aquí para ver más grande la figura . Figura 2. La fusión mitocondrial inhibido con palmitato 0,4 mM disminuye la dilución del PA-GFP. A. Proyecciones de 6 secciones ópticas que muestran las mitocondrias corto con una intensidad de la señal cambia con el tiempo. Colocalización B. PA-GFP con TMRE muestra que las mitocondrias no son depolarizado. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Discussion

Este método permite la formación de imágenes de alrededor de 10 células a la vez, si la adquisición se produce cada 15 minutos después de la fotoactivación. El número exacto de células dependerá de lo rápido que uno es capaz de localizar y marcar las células que expresan mtPAGFP dentro de la placa de cultivo, y la rapidez con que se puede configurar todos los parámetros del software. Para realizar la automatización sin problemas una capa uniforme de las células deben ser utilizados porque los designados z-stack márgenes se aplicará para todas las células.

El tamaño de esta zona fotoactivación inicial regirá el tiempo de equilibrado. Para ser capaz de medir la fusión mitocondrial, es importante para fotoactivar sólo 10-20% de la red, de tal manera que la propagación de la señal al resto de la red se puede controlar con el tiempo. Si es demasiado buena parte de la red se fotoactivados, es posible que la fusión completa se producen con demasiada rapidez, y el evento no será capturado.

El cuidado extremo se debe tomar paraajustar la potencia del láser del láser de dos fotones, así como la concentración TMRE para evitar fototoxicidad que conduce a la despolarización mitocondrial. Asegurarse de que la señal de mtPAGFP colocalizes con la señal de TMRE puede ayudar en la evaluación de fototoxicidad y la salud general de las células ^8,15. La iluminación con luz epifluoerescent debe ser evitado. Si bien la búsqueda de células que expresan mtPAGFP, el agujero debe ser lo más abierto durante la exploración con una excitación de 488 nm de bajo poder. Ajuste de la potencia del láser de dos fotones para fotoactivar suficiente PA-GFP para medir la señal durante 1 hora, pero no a sobresaturar cualquiera de las celdas puede ser complicado ^8. Sin embargo, el tiempo debe ser gastado en esta etapa debido a la optimización de programa automático se inicia, es tedioso para detenerlo, para elegir más células, y curriculum vitae.

Para el control de la calidad, la adquisición de un contraste de interferencia diferencial (DIC) de la imagen (o de luz transmitida) para controlar el foco en las células puede ser muyútil y también una buena manera de detectar las burbujas formadas en el aceite de inmersión durante la exploración, lo que ocurre a veces de los movimientos de la etapa.

Aunque el uso de este método mtPAGFP recoge datos sobre el movimiento unidireccional de proteínas de la matriz mitocondrial de las mitocondrias fotoactivados a los que no están etiquetados, es posible utilizar esta técnica para estudiar otros procesos. Por ejemplo, fluorocromos específicos se puede unir a las proteínas de membrana para observar su movimiento específico durante los eventos de fusión, como se ha demostrado para ABC-me, la fusión de la que se produce en una escala de tiempo diferente de la mezcla de proteínas de la matriz solubles ^15.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Zeiss