Una più veloce, ad alta risoluzione, MTPA-GFP-based test Fusion mitocondriale Acquisizione dati cinetici di più celle in parallelo con microscopia confocale

Summary

Fusione mitocondriale è stato misurato mediante il monitoraggio di equilibrare le photoconverted matrice mirata GFP attraverso la rete mitocondriale nel corso del tempo. Finora, una sola cella può essere sottoposto ad un'ora lunga analisi cinetica alla volta. Vi presentiamo un metodo che misura contemporaneamente più celle, in modo da accelerare il processo di raccolta dati.

Abstract

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.

Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis^1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks^4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function¹⁸. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust¹⁴. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis⁹. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.

Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay⁷, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay^1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process ^4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.

A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)^6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal⁶. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE^9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.

The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity^8,15,16,17.

In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE⁸ in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO₂, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Protocol

1. Immagine Piastra Preparazione Cultura INS1 cellule RPMI supporti contenenti standard del 10% siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina, 2 mM L-glutammina, 50 pM 2-mercaptoetanolo, 5 mM NaHCO 3, 2 mM di HEPES, 2 mM acido piruvico, e 11 mM di glucosio al 80% di confluenza. Tripsinizzare le colture cellulari INS1 con 0,05% tripsina e li piastra su poli-D-lisina coprioggetto rivestiti con fondo fosfori confluenza (30-40%). Lasciare per piatti di raggiungere confluenza del 60-80% (circa 2 giorni) e aggiungere matrice mitocondriale mirati (COXVIII) adenovirale PA-GFP per 24 ore (MOI = 5). Media Exchange e consentono alle cellule di crescere per altri 2 giorni prima di imaging. Il giorno di immagini, aggiungere TMRE 7-15 nM per le piastre di imaging, ed equilibrare per almeno 45 min. Durante questo tempo sul giro l'incubatore (fase superiore incubatore è stato usato qui) e permettono il microscopio equilibrare a 37 ° C per circa 1 ora. Accendere il 5% di CO 2. </li> 2. Parametri di imaging per la Zeiss LSM 710 microscopio confocale Dopo che il microscopio ha equilibrato, nella scheda di acquisizione, fare clic su "Strumenti manuale mostrano", aprire l'imaging istituito pannello e scegliere "la modalità del canale" e passare rintracciare ogni "frame". Nel pannello percorso della luce, scegliete LSM e la modalità del canale. Lavorare da l'icona del campione verso l'alto, selezionare "posteriore", MBS 690 + e MBS 488. Nella parte inferiore del pannello, scegliere "T-PMT" per consentire la visualizzazione del canale in campo chiaro o DIC. Terminare la regolazione dei parametri di Light Path impostando l'intervallo per il colorante GFP a 490-540 nm e 580-700 nm per il colorante TMRE. Nella modalità di acquisizione, utilizzare un 512 × 512 pixel campo di scansione, 4x media, e scegliere un fattore di zoom (che si consiglia di mantenere coerente per scopi di taratura). 3. Ottimizzazione dei parametri di imaging Utilizzando il piano apocromatico 100x (1,4 NA) lente dell'obiettivo, focnoi le vostre cellule con la luce alogena non, luce fluorescente, per proteggere i mitocondri da fototossicità. Schermo per PA-GFP cellule che esprimono con un foro di massima apertura e la scansione per individuare le cellule che sono più luminosi verdi. Trovare la minima potenza del 2-fotone laser necessaria per attivare il PA-GFP e ottimizzare i parametri di imaging garantire che il segnale non saturare il rivelatore. Controllare che il PA-GFP colocalizza segnale con il segnale TMRE per pochi z-serie. Perdita del segnale TMRE indica depolarizzazione mitocondriale o fototossicità, e cellule che presenta queste caratteristiche non devono essere utilizzati per l'analisi. Trova un PA-GFP cellula che esprime e specificare un fattore di zoom. Impostare la serie Z gamma di raccogliere 6 fette (questo intervallo sarà necessario per soddisfare tutte le 10 celle a meno che una specifica z-messa a fuoco è impostata a ciascuna posizione). Salvare il metodo di imaging per ogni cella (cella 1, cella 2 ecc.) 4. Regolare il AutomatePorzione d del programma e designare i 10 celle si seguirà per il test 1 Fusion Hour mitocondriale Sul pannello di sinistra della finestra Multitime, selezionare il pannello "risparmio", e specificare il percorso dove i file verranno salvati. Nel pannello "Acquisizione", caricare il metodo di acquisizione salvato per cella 1 nella configurazione di scansione e selezionare la casella pila z. Scegli anche "segnato Z-middle dello stack z". Nel pannello "blocchi", selezionare "blocco unico in ogni sede". Fare clic su "Aggiungi" per blocchi di ogni intervallo da misurare. Nel pannello "timing", selezionare "attendere l'intervallo" e tipo "0" in "intervallo di attesa prima del blocco alla prima posizione solo". Blocchi 2-4 avrà "15 minuti" in questa sezione. Nel pannello posizione, scegliere "spostare lo stato attivo per caricare posizione tra percorsi" e "carico scansione config quando 'passare alla loc' o 'Avanti loc' cliccato. Sotto" modifica posizioni "scegliere" cancella tutto "e poi selezionare" multiple posizioni motorizzata stage ". Under il pannello di "Bleach", selezionare la casella "candeggina", e designa il file di configurazione in "config" menu a discesa, come indicato nella finestra del software principale. Quindi, nella finestra "bleaching", salvare il metodo appropriato fotoattivazione. Nel pannello regioni, scegliere il ROI per questa cella particolare, e aggiungere il ROI al Multitime scegliendo "add area corrente alla lista ROI" finestra. Assicurarsi di selezionare la stessa posizione nella "ROI" menu a discesa. Per la tempistica per funzionare correttamente e per ogni cella di avere un intervallo di 15 minuti, due metodi devono essere salvate. Nell'elenco dei blocchi, il primo avrà la configurazione "reale" fotoattivazione, e il resto avrà una configurazione "finto" che non utilizza il laser a due fotoni. Il primo blocco sarà anche l'unico blocco che non ha un ritardo (BKIntv = 0). Pertanto, il metodo inizia con una scansione di base, seguito da una scansione fotoattivazione. Il resto dei blocchi hanno un secondo BkIntv 900, ead ogni tempo ci sono due scansioni così come al tempo 0 sec, per mantenere la coerenza tempi. Per ciascuna delle celle 10 da seguire nel tempo, eseguire questa sequenza: Trova un PAGFP esprime cellule salvare il suo metodo di imaging Posizione pannello marcare la posizione stadio, specificare metodo di imaging Principale ROI pannello scegliere una regione di interesse per essere Bleach fotoattivati ​​pannello salvare ROI specifico e caricare anche nella casella ROI: Cancellare il ROI e ripristinare lo zoom scansione a 1 Trova la cella successiva e impostare lo zoom Ripetere la procedura per i prossimi 9 celle Controllare che ogni posizione stadio e tutti i blocchi hanno il metodo appropriato imaging (scan configurazione) associato. Assicurarsi inoltre che il primo blocco in ogni sede corrisponde al metodo fotoattivazione appropriato, mentre il resto contiene un metodo "mock". Infine, selezionare "Esegui". 5. Analizzare la PA-GFP intensità di segnale <li> Per le cellule in cui il fotoattivabile-GFP segnale colocalizza TMRE con il segnale rosso, sottrarre il fondo nelle immagini PAGFP (qui usiamo Metamorph). Poi esportare i dati in Excel e calcolare l'intensità media per z-stack in ogni punto. Eliminare sezioni ottiche che non hanno segnale. Misurare la diluizione segnale in ciascun z-stack calcolando la percentuale del segnale originale fotoattivati. Ogni punto i dati vengono analizzati e registrata due volte, con conseguente duplicazione Z-Stack informazioni per ogni punto temporale. Verificare che i valori di Z-Stack d'accordo. Se non, ciò è indicativo di un problema (ad esempio fuoco, il movimento delle cellule). 6. Risultati rappresentativi Quando un evento di fusione si verifica tra un attivato e non attivato, PA-GFP mitocondrio, il PAGFP nella matrice mitocondriale mescola con la matrice non marcato e si diluisce su un'area più grande, diminuendo il segnaleintensità (Figura 1A). Nella cella INS1, una significativa diminuzione dell'intensità del segnale avviene ogni 15 minuti, fino equilibrio della fusione mitocondriale è stato raggiunto (circa 1 ora). Si noti che la cella nella Figura 1B mostra colocalizzazione quasi completa della PA-GFP e segnali TMRE. In questi saggi una concentrazione molto bassa di TMRE (15 nM) è utilizzato per indirizzare la fotoattivazione di PAGFP, e anche per monitorare la salute delle cellule. Le cellule con un'abbondanza di mitocondri depolarizzata avrà colocalizzazione incompleto di PAGFP e TMRE e non dovrebbe essere analizzato in quanto questo indica sia fototossicità, o cellule in uno stato di morte. Il tempo di equilibrazione di fusione mitocondriale è solitamente 1 ora in INS1 cellule, quando ~ 15% del volume mitocondriale è attivato. A volte, anche se una piccola area illuminata, la maggior parte dei mitocondri diventano fotoattivato a causa di essere altamente rete, nel qual caso fusione ulteriore è difficile da rilevare. Altri tipi di cellule possono presentare diversi tempi di equilibrazione e dovrebbe essere testato ad intervalli più brevi e per un periodo più lungo per caratterizzare le dinamiche mitocondriali. Per inibire la fusione mitocondriale, le cellule possono essere collocato all'interno di un ambiente lipotoxic. È stato precedentemente dimostrato che 0,4 mM palmitato frammenti mitocondri, e inibisce fusione mitocondriale 9. Questo effetto può essere visto in Figura 2, dove vengono frammentati mitocondri, ma l'intensità del segnale della mtPAGFP non cambia quanto in condizioni normali (figura 1). Pertanto, la diluizione del PA-GFP segnale è probabilmente dovuto alla fusione mitocondriale anziché fissione. In altri tipi di cellule, si consiglia di utilizzare altri metodi noti per indurre frammentazione mitocondriale, come silenziamento OPA1 che è necessaria per la fusione mitocondriale 14. Figura 1. </strong> diluizione tipica del PA-GFP segnale dopo fotoattivazione durante un saggio di fusione mitocondriale. A. PA-GFP diventa progressivamente dimmer causa di eventi di fusione mitocondriali che portano alla diluizione della proteina su un'area maggiore come si vede in queste immagini proiettate di 6 sezioni ottiche quantificato ogni 15 minuti. B. TMRE con PA-GFP mostra che i mitocondri sono attivi e non depolarizzato. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 2. Fusione mitocondriale inibito con palmitato 0,4 mM diminuisce la diluizione della PA-GFP. Proiezioni A. 6 sezioni ottiche che mostrano i mitocondri a breve con una intensità di segnale immutabile nel tempo. Colocalizzazione B. PA-GFP con TMRE dimostra che i mitocondri non sono depolarizzata. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

Questo metodo consente l'imaging di circa 10 celle per volta, se l'acquisizione avviene ogni 15 minuti dopo fotoattivazione. Il numero esatto delle cellule dipende da quanto velocemente si è in grado di individuare e marcare le cellule che esprimono mtPAGFP all'interno della capsula di Petri, e quanto velocemente si possono impostare tutti i parametri del software. Per rendere l'automazione senza intoppi uno strato uniforme di cellule devono essere utilizzati perché i designati Z-Stack margini si applica per tutte le celle.

Le dimensioni di questa area fotoattivazione iniziale governare il tempo di equilibrio. Per poter misurare la fusione mitocondriale, è importante photoactivate solo il 10-20% della rete, in modo tale che la diffusione del segnale al resto della rete può essere monitorata nel tempo. Se troppo della rete è fotoattivato, è possibile che la fusione completa si verifica troppo rapidamente, e l'evento non sarà catturato.

Estrema cura deve essere presa aregolare la potenza del laser di due fotoni laser, nonché la concentrazione TMRE fototossicità per evitare che porta alla depolarizzazione mitocondriale. Garantire che il segnale mtPAGFP colocalizza con il segnale TMRE può aiutare nella valutazione fototossicità e la salute delle cellule in generale ^8,15. Illuminazione con luce epifluoerescent deve essere evitato. Durante la ricerca di cellule che esprimono mtPAGFP, il foro deve essere di massima apertura durante la scansione con eccitazione 488nm bassa potenza. Regolazione due fotoni potenza del laser photoactivate sufficiente PA-GFP per misurare il segnale in 1 ora, ma non saturare eccessivamente qualsiasi delle cellule può essere difficile ^8. Tuttavia, il tempo dovrebbe essere speso in questa fase di ottimizzazione perché il programma automatico, una volta avviato, è noioso per fermarlo, per selezionare altre celle, e riprendere.

Per il controllo della qualità, l'acquisizione di un contrasto di interferenza differenziale (DIC) l'immagine (o luce trasmessa) per monitorare l'attenzione sulle cellule possono essere moltoutile e anche un buon modo per rilevare bolle formatesi nella immersione in olio durante la scansione, questo accade a volte dai movimenti del palcoscenico.

Anche se questo metodo mtPAGFP raccoglie dati sul movimento unidirezionale di proteine ​​della matrice mitocondriale mitocondri fotoattivato a quelli che non sono etichettati, è concepibile utilizzare questa tecnica per studiare altri processi. Ad esempio, fluorocromi specifici può essere collegato a proteine ​​di membrana per osservare il loro movimento specifico durante eventi di fusione, come è stato mostrato per ABC-me, la fusione di che si verifica su una scala di tempo differente dalla miscelazione di proteine ​​di matrice solubili ^15.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Zeiss