Den α-test: Snabb Cell-free CD4 Enumeration Använda Hela Saliva

Summary

En CD4 uppräkning metod, α-test, beskrivs som använder hela saliv för att ge snabba och korrekta CD4-tal. De α-test kostar småpengar och eliminerar behovet av tekniska utbildning, dyra reagens såsom monoklonala antikroppar, instrumentering, kyl, transport av prover, samt insamling och hantering av blod.

Abstract

Det finns ett akut behov av prisvärda CD4 räkning för att övervaka HIV-sjukdom. CD4 uppräkning är utom räckhåll i resurssvaga begränsade regioner på grund av den tid och restriktioner temperatur, avancerade teknik, och kostnader för reagenser, särskilt monoklonala antikroppar för att mäta CD4 på blodkropparna, den enda för närvarande acceptabel metod. Ett vanligt använt kostnadsbesparande och tidsbesparande laboratoriet strategi är att beräkna, snarare än mäta vissa blodvärden. Till exempel är LDL-nivåer beräknas med användning av de uppmätta nivåerna av totalt kolesterol, HDL och triglycerider ^1. Sålunda räknar identifiering av cellfria korrelerar att direkt reglera antalet av CD4 ⁺ T-celler skulle kunna tillhandahålla en noggrann metod för beräkning av CD4 på grund av den fysiologiska relevansen av de korrelerar.

Antalet stamceller som anger blod och är avsedda att bli cirkulerande CD4 ^+-T-celler bestäms av kemokin CXCL12 ennd dess receptor CXCR4 på grund av deras inverkan på rörelse ^2. Förfarandet enligt stamceller förflyttning in i blod är dessutom regleras genom cellytan humant leukocytelastas (HLE _CS) och HLE _CS-reaktiv aktiv α _{1-proteinasinhibitor} (α ₁ PI, α _{1-antitrypsin,} SerpinA1) ^3. Hos HIV-1 sjukdom, α ₁ PI inaktiveras på grund av sjukdomsprocesser ^4. I början asymtomatiska kategorier av HIV-1 sjukdom, var aktiva α ₁ PI visade sig vara under det normala i 100% av obehandlade HIV-1-patienter (median = 12 M, och för att uppnå normala nivåer under den symptomatiska kategorierna ^{4, 5.} Här Mönstret har tillskrivits immunförsvaret inaktivering, inte tillräckligt syntes, proteolytisk inaktivering eller syresättning. Vi observerade att i HIV-1 patienter med> 220 CD4-celler / l, var CD4 korrelerade med serumnivåer av aktiv α ₁ PI (r ² = 0,93, p &lt; 0,0001, n = 26) och inaktiva α ₁ PI (r ² = 0,91, p <0,0001, n = 26) ^5. Administration av α ₁ PI till HIV-1 infekterade och oinfekterade personer resulterade i dramatiska ökningar i CD4 tyder α ₁ PI deltar i regleringen av antalet CD4 ⁺ T-celler i blodet ^3.

Med stimulering, innehåller helt saliv räcker serös exsudat (plasma innehåller proteinhaltigt material som passerar genom blodkärlens väggar i saliven) för att möjliggöra mätning av aktiv α ₁ PI och sambandet mellan denna mätning är ett bevis att det är en exakt metod för att beräkna antal CD4-celler. Kortfattat sialogogues såsom tuggummi eller citronsyra stimulera utsöndring av serum i hela munnen saliv. Efter stimulering serum exsudation, är aktiviteten av serum α ₁ PI i saliv mätt genom dess förmåga att inhibera elastas-aktivitet. Porcint pankreatiskt elastas (PPE)är en lätt tillgänglig billig källa av elastas. PPE binder till α ₁ PI bildar en en-till-ett komplex som förhindrar PPE från klyva dess specifika substrat, av vilka en är den kolorimetriska peptid, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA ³ NA). Inkubera saliv med en mättande koncentration av PPE under 10 min vid rumstemperatur tillåter bindning av PPE till alla aktiva α ₁ PI i saliv. Den resulterande hämning av personlig skyddsutrustning av aktiv α ₁ PI kan mätas genom att tillsätta PPE underlaget SA ³ NA. (Figur 1). Även om CD4-antal mäts i termer av blodvolymen (CD4 celler / fil), är koncentrationen av α ₁ PI i saliv relaterat till koncentrationen av serum i saliv, för att inte volym saliv, eftersom volymen kan variera avsevärt under dag och person till person ^6. Emellertid är praktiskt taget allt protein i saliv grund serumhalt, och proteinhalten i saliv är MEAmätbara ^7. Således är aktiv α ₁ PI i saliv beräknas som förhållandet mellan till saliv proteininnehåll och benämns α ₁ PI index. Resultat som presenteras här visar att α ₁ PI Index ger en noggrann och exakt fysiologiska metod för beräkning av CD4-tal.

Protocol

1. Förbered Färska Fungerande lösningar TBS: 0,05 M Tris-buffrad saltlösning, pH 7,8 (TBS). Framställ 60 ml TBS / mikroplatta. PPE: Porcint pankreatiskt elastas, typ 1 (PPE) är anordnad som en suspension. Skaka väl och späd PPE i TBS till cirka 0,01 U / ml. Framställ 6 ml arbetslösning / mikroplatta). SA 3 NA: succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA 3 NA). Framställa 0,1 M stamlösning SA 3 …

Discussion

Outspätt serum innehåller median 36 pM α ₁ PI och 3,6 | iM α ₂ makroglobulin (α ₂ M) en 10-faldig skillnad ^8. Båda proteinerna att konkurrera för bindning till PPE. Dessa två egenskaper, koncentration och PPE affinitet, har utnyttjats för att utveckla en metod som är kapabel att specifikt mäta α ₁ PI i normalt serum i närvaro av konkurrerande α ₂ M ^8. Denna metod kan detektera så lite som 50 nM μ ₁ PI 0,3% serum. Vid …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sialogogue, 0.05M citric acid	Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144	Sugar-Free Lemon dropS
Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103	E1250
Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	S4760
Coomassie Brilliant Blue R-250	Sigma-Aldrich	B7920
Tissue culture-treated, 96 well microplates	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886	35-3072
Microplate Reader with filters for 405 nm and 595 nm	MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182	Dynex P97277