एक मात्रात्मक स्वास्थ्य विश्लेषण कार्यप्रवाह

Summary

के मात्रात्मक स्वास्थ्य विश्लेषण (QFA) माइक्रोबियल संस्कृति fitnesses का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल विधियों के पूरक श्रृंखला है. QFA आनुवंशिक परिवर्तन, दवाओं या अन्य सूक्ष्म जीव विकास पर लागू उपचार के प्रभाव का अनुमान है. प्रयोगों एकल संस्कृतियों का ध्यान केंद्रित विश्लेषण से समानांतर संस्कृतियों के हजारों करने के लिए स्केलिंग बनाया जा सकता है.

Abstract

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel^1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.

The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.

QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods^5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases³. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously¹.

Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.

We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Protocol

पुस्तिका QFA प्रोटोकॉल (एस cerevisiae उपभेदों के लिए) 1. संवर्धन खमीर खींच 96 स्वतंत्र खमीर उपभेदों के लिए अमीर तरल मीडिया की 200 μl में 96 अच्छी तरह से एक संस्कृति डिश में संवर्धित कर रहे हैं. उपभेदों एक इनक्यूबेटर नियंत्रित तापमान में संतृप्ति के लिए बड़े हो रहे हैं. एक 96 पिन, 1/8 "व्यास पुस्तिका प्रतिकृति प्लेटर (सिग्मा आर – 2508) पहली बार 100% इथेनॉल में प्रतिकृति प्लेटर सूई, ज्वलंत और फिर शांत करने के लिए छोड़ने के द्वारा निष्फल है. बाँझ पानी के 200 μl 96 अच्छी तरह से एक संस्कृति थाली में arrayed है. संतृप्त संस्कृतियों (Eppendorf MixMate, 30 सेकंड, 750 आरपीएम) vortexed की कर रहे हैं और प्लेट युक्त पानी एक बार में रोगाणु मुक्त पिन उपकरण संतृप्त उपभेदों में तीन बार की सूई फिर से पतला. पिन उपकरण के रूप में 1.2 प्रति फिर से निष्फल. रोगाणु मुक्त पिन उपकरण बेचा अगर प्लेट पर पतला संस्कृति हाजिर थाली में सूई पतला संस्कृति वाले तीन बार के द्वारा प्रयोग किया जाता हैn एक आयताकार ठोस अगर थाली करने के लिए पिन उपकरण स्थानांतरित. आयताकार ठोस अगर प्लेटों को मैन्युअल रूप से एक एस एंड पी रोबोटिक spImager का उपयोग imaged किया पहले एक उचित तापमान पर incubated हैं. वैकल्पिक तरीकों छवि पर कब्जा भी किया जा सकता है LAS4000 FUJIFILM, या एक कम महंगा डिजिटल एसएलआर कैमरा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर की देखभाल के लिए भी रोशनी और लगातार प्लेट इमेजिंग कैमरा के सापेक्ष स्थिति को सुनिश्चित करने के लिए लिया जाता है. विधि 48 के रूप में समानांतर संस्कृतियों, जो दौर पेट्री डिश पर लगाया जा सकता है अगर की देखभाल के लिए प्रत्येक तस्वीर के दौरान एक ही इमेजिंग कैमरा कोण करने के लिए सापेक्ष सुनिश्चित करने के लिए लिया जाता है की छोटी संख्या के लिए अनुकूल है. पूरी तरह से स्वचालित QFA प्रोटोकॉल (एस cerevisiae उपभेदों के लिए) 2. संवर्धन खमीर खींच ठोस अगर बढ़ती स्वतंत्र खमीर उपभेदों के एक आयताकार सरणी के साथ शुरू करो. इस उदाहरण में शुरू उपभेदों तापमान पार का परिणामसिंथेटिक जेनेटिक एरे (SGA) द्वारा खमीर विलोपन संग्रह (YDC) के साथ संवेदनशील क्वेरी उत्परिवर्तन. अंतिम SGA प्लेटें 1536 प्रारूप में हैं. यह कालोनियों / चार प्रतिनिधित्व संस्कृतियों के 24 स्तंभ द्वारा 16 पंक्तियों 384 स्वतंत्र खमीर उपभेदों की प्रतिकृति है. थाली के लेआउट के लिए चित्रा 1 देखें. 1536 में से 384 उपभेदों यन्त्र – मानव स्थानांतरित कर रहे हैं एक 96 पिन, 1 मिमी पिन व्यास बाँझ pintool साथ चार 96 अच्छी तरह से संस्कृति चयनात्मक मीडिया के 200 μl (चित्रा 1) युक्त प्लेटों में एक एस एंड पी रोबोटिक इंक BM3-अनुसूचित जाति रोबोट का उपयोग कर. Pintool सफाई और बाँझपन बाँझ पानी में क्रमिक रूप में दो बार (एक बार एक परिक्रामी ब्रश मलबा हटाने के साथ) धोने, 70% इथेनॉल (sonication के साथ) और अंत में 100% इथेनॉल द्वारा हासिल की है. संस्कृतियों संतृप्ति के लिए हो जाता है (20 से कम तीन दिनों के लिए ° सी इस उदाहरण में, चित्रा 1 देखें). 3. खमीर संस्कृति खोलना के Beckman Biomek FX, संतृप्त संस्कृतियों का उपयोगफिर एक Variomag Teleshake (20 सेकंड के लिए 1000rpm पर वामावर्त) पर vortexing resuspended और 200 μl बाँझ पानी में लगाए एक बाँझ 96 पिन रोबोट पिन उपकरण (वी पी एंड वैज्ञानिक चुंबकीय pintool बढ़ते, 2 मिमी पिन व्यास) का उपयोग करके लगभग 1:70 पतला. पिन उपकरण सफाई और बाँझपन बाँझ पानी में धोने से हासिल की है, 70% इथेनॉल में धोने के मलबे को हटाने के लिए एक ब्रश के साथ () और अंत में 70% के बाद सूखने से इथेनॉल में सूई. पतला संस्कृतियों 384 प्रारूप में ठोस अगर सफाई और नसबंदी के बाद एक ही रोबोट पिन उपकरण (चित्रा 1 देखें) का उपयोग कर प्लेट पर देखा जाता है. लगाए के बाद, प्लेटें स्वचालित हिंडोला और उपयोग पक्षियों के बच्चे के साथ एक Cytomat तापमान नियंत्रित, humidified इनक्यूबेटर में स्थानांतरित कर रहे हैं. 4. छवि कैद एक एस एंड पी रोबोटिक स्वचालित imager के बार बार Cytomat इनक्यूबेटर से प्लेट हटा, हटा थाली ढक्कन, उन्हें ठीक लगा देना के तहत स्थानोंघ, एक Canon EOS विद्रोही तिवारी 35 मिमी DSLR नीचे समान रूप से प्रबुद्ध अंतरिक्ष, एक छवि 5184 x 3456 पिक्सल संकल्प पर कब्जा, जगह थाली ढक्कन, और उन्हें इनक्यूबेटर हिंडोला देता है. एक छवि तुरंत इनक्यूबेटर में प्रारंभिक हस्तांतरण के लिए एक शून्य समय बिंदु विकास माप (पृष्ठभूमि) के लिए अनुमति के बाद कब्जा कर लिया है. रोबोट से निपटने और फोटोग्राफी प्रति प्लेट 2 मिनट लगते हैं. एक पूरी तरह से भरा हुआ हिंडोला के साथ, अधिकतम प्राप्त थाली छवि पर कब्जा आवृत्ति एक तस्वीर के हर छह घंटे है. प्लेटों के लिए incubated हैं छह दिनों (कॉलोनी वृद्धि संतृप्ति तक चित्रा 1 तीन 20 डिग्री सेल्सियस पर एक समय पाठ्यक्रम से ठेठ छवियों से पता चलता है. ट्रैकिंग के प्रयोजनों के लिए, प्लेटें इनक्यूबेटर नाम, तापमान, अद्वितीय अनुक्रमिक बैच और इनक्यूबेटर में संख्या स्थिति के अनुसार नाम हैं. छवि नाम प्लेट नाम और टाइमस्टैम्प की एक कड़ी हैं और स्वचालित रूप से छवि पर कब्जा करने पर निर्माण (जैसे K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg फ़ाइल प्रकार एफटी1, Table1). 5. प्रायोगिक मेटाडाटा का कब्जा मेटाडेटा इस खंड में वर्णित फाइलें टैब – सीमांकित पाठ फ़ाइलें जो मैन्युअल रूप से उत्पन्न कर रहे हैं (जैसे स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर) कर रहे हैं. प्रायोगिक विवरण फ़ाइल (ft2, तालिका 1) प्रत्येक प्रयोग करने के लिए अद्वितीय है, लेकिन पुस्तकालय विवरण (FT3, तालिका 1) बड़े पैमाने पर एक बार का निर्माण किया जा सकता है फिर से इस्तेमाल किया. प्रयोग के साथ पुस्तकालयों के लिए प्रायोगिक विवरण (ft2, Table1) के फ़ाइल युक्त बारकोड लिए स्तंभ (या स्वतः उत्पन्न प्लेट नाम), प्रयोग शुरू टाइमस्टैम्प, प्लेट उपचार, ठोस अगर मध्यम, स्क्रीन नाम, पुस्तकालय, प्लेट संख्या (की सामग्री में वर्णित है कई प्लेटें) और 1536 प्रारूप से 384 प्रारूप करने के लिए नीचे स्केलिंग के लिए एक दोहराने – वृत्त का चतुर्थ भाग संख्या (चित्रा 1 देखें). खमीर तनाव पुस्तकालय पुस्तकालय विवरण (फ़ाइल FT3 के साथ वर्णित है, <stronजी Table1>) एक पुस्तकालय के प्रत्येक प्लेट में प्रत्येक संस्कृति स्थान में हो जीनोटाइप हुए कहा. पुस्तकालय नाम, ओआरएफ, नंबर प्लेट, थाली पंक्ति, प्लेट स्तंभ और एक वैकल्पिक नोट स्तंभ: यह के लिए कॉलम शामिल हैं. एक वैकल्पिक मानक जीन नाम (FT4, तालिका 1) फ़ाइल मानक जीन (RAD9 उदाहरण के लिए) नाम प्रत्येक व्यवस्थित y संख्या ओआरएफ (जैसे YDR217C) जा रहा है जांच उपभेदों की पहचान के साथ जुड़े का वर्णन प्रदान किया जा सकता है. ओआरएफ और जीन नाम: इस फाइल में दो कॉलम शामिल हैं. 6. डेटा विश्लेषण QFA कम्प्यूटेशनल वर्कफ़्लो एक काफी शक्तिशाली कंप्यूटर (उदाहरण के लिए Xeon Quad-कोर 2.67 GHz प्रोसेसर और 12GB राम के साथ एक डेल प्रेसिजन T3500) मल्टीकोर वर्कस्टेशन पर जो विश्लेषण Colonyzer छवि सॉफ्टवेयर 3,4 उपकरण और QFA आर 7 पैकेज स्थापित किया गया है करने के लिए उपयोग की आवश्यकता है , जो दोनों के ऑनलाइन प्रलेखित रहे हैं, आज़ादी से उपलब्ध हैं और ऑपरेटिंग सिस्टम की एक श्रृंखला पर चला. इनपुट के रूप में कब्जा कर लिया प्लेट छवियों के प्रत्येक के साथ Colonyzer भागो, प्रत्येक पर कब्जा कर लिया छवि के लिए एक Colonyzer आउटपुट फ़ाइल (FT5 तालिका 1). Colonyzer आउटपुट फाइल संस्कृति घनत्व का अनुमान है, संस्कृति के क्षेत्र, आकार और छवि प्लेट पर 384 स्थानों में से प्रत्येक के लिए रंग निर्दिष्ट करें. आउटपुट फ़ाइल नाम स्वतः स्रोत छवि फ़ाइल नाम से नकल की है (उदाहरण के लिए थाली तस्वीर K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, तालिका 1) Colonyzer उत्पादन फ़ाइल K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat से मेल खाती है ( FT5, तालिका 1)). QFA आर पैकेज का प्रयोग, प्रयोगात्मक (ft2, Table1) के मेटाडाटा और Colonyzer आउटपुट फाइल (FT5 तालिका 1) लोड. ये डेटा अनुसंधान और आगे के विश्लेषण के लिए डेटा फ्रेम (जो QFA कच्चे डेटा पाठ फ़ाइलें (FT6, तालिका 1) के रूप में निर्यात किया जा सकता है) में विलय कर रहे हैं. QFA आर पैकेज कार्यों में शामिल प्रत्येक संस्कृति के लिए सेल घनत्व timecourses को इकट्ठा, सामान्यीकृत लो फिटटिप्पणियों के लिए और साजिश करने के लिए gistic जनसंख्या मॉडल दोनों (उदाहरण के लिए 2 आंकड़े और 3 देखें). फिट पैरामीटर मान QFA उपस्कर पैरामीटर फाइल (FT7 तालिका 1) के लिए लिखा जाता है. अधिक जानकारी के लिए QFA आर पैकेज प्रलेखन देखें. QFA आर पैकेज भी गुणवत्ता नियंत्रण के लिए कार्य शामिल हैं: धार कालोनियों पोषक तत्वों की अधिक से अधिक उपलब्धता के कारण थाली किनारों और कठिनाई में प्लेट दीवारों, संस्कृतियों, जो SGA और जीनोटाइप स्क्रीन विशेष मार्कर जीन के साथ संबंध प्रदर्शित करने में विफल रहा है के पास छवि विश्लेषण के साथ खारिज कर रहे हैं विश्लेषण से छीन कर रहे हैं. कई मात्रात्मक फिटनेस उपायों प्रत्येक संस्कृति के लिए रसद जनसंख्या मॉडल मापदंडों से प्राप्त कर रहे हैं. अधिकतम जनसंख्या दुगनी दर (एमडीआर) और डिवीजनों की टीका से संतृप्ति (एमडी) संख्या में शामिल हैं. दोहराने संस्कृतियों के प्रत्येक सेट (उदाहरण के लिए अद्वितीय जीनोटाइप) के लिए और प्रत्येक फिटनेस परिभाषा के लिए फिटनेस का अनुमान है कई सारांश आँकड़े COMP रहे हैंuted: मतलब और मंझला फिटनेस, फिटनेस मानक विचलन और की संख्या प्रतिकृति मनाया. सारांश आँकड़े आगे के विश्लेषण के लिए QFA स्वास्थ्य सारांश फाइलें (FT8, तालिका 1) उत्पादन, आनुवंशिक बातचीत स्कोर (FT9 तालिका 1) का उदाहरण गणना कर रहे हैं. 7. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 384 QFA ° सी ठोस अगर रूप में Colonyzer द्वारा मात्रा पर 20 से बढ़ रहा है, सेल घनत्व में वृद्धि के साथ पहली बार लगभग 2 दिनों के बाद detectable बनने संस्कृतियों के एक ठेठ विकास की अवस्था से पता चलता है. इस देरी की संभावना ठोस मध्यम और सेल घनत्व के लिए एक का पता लगाने की निचली सीमा पर टीका के बाद एक संस्कृति अंतराल चरण के संयुक्त प्रभाव है चित्रा 3 308 समान विकास एक ही थाली से कब्जा कर लिया घटता से पता चलता है. चित्रा 4 दो जीनोम चौड़ा की तुलना दर्शाता है QFA के लिए आनुवंशिक स्क्रीन अनुमान केबातचीत की ताकत (1 से अनुकूलित). QFA आर पैकेज 7 भी चित्रा 3 का उत्पादन और उत्पादन की जांच जीनोटाइप और आनुवंशिक बातचीत ताकत (जीआईएस) के अनुमान के स्थान पर सूची है, के लिए एक क्ष मूल्य (झूठी डिस्कवरी दर (एफडीआर) सही पी मूल्य) के साथ मिलकर कार्य भी शामिल है मनाया जीआईएस का महत्व. आकृति 1. खमीर उपभेदों के 384 स्थान प्रारूप में रोबोट टीका के लिए योजना. इस प्रक्रिया प्लेट प्रति 1536 स्वतंत्र संस्कृतियों (बाएं) के साथ शुरू होता है. इस विशिष्ट उदाहरण में, 1,1 पदों पर कालोनियों, 1,2, 2,1 और 2,2 (लाल रंग) से चार वही जीनोटाइप की प्रतिकृति his3 :: पीले में KANMX संस्कृतियों, थाली के किनारे पर बढ़ रहा है. , एक विकास प्रतियोगिता की कमी के कारण लाभ है और इसलिए QFA द्वारा जांच नहीं कर रहे हैं. इन प्रतिकृति (1,1) जैसे तरल विकास मीडिया में 96 अच्छी तरह से थाली में टीका 96 पिन जो 1536 कालोनियों प्रत्येक समय के बाहर 96 inoculates एक उपकरण का उपयोग कर. आदेश में 384 जीन विलोपन, चार अलग अलग "quadrants" (लाल, नीले, हरे और बैंगनी रंग के रूप में संकेत) में से प्रत्येक के लिए एक दोहराने टीका लगाना करने के लिए चार अलग अलग 96 अच्छी तरह से विकास मीडिया वाले प्लेट में inoculated हैं. वृद्धि संतृप्ति के लिए (जैसे 3 दिन में 20 डिग्री सेल्सियस) के बाद, संस्कृतियों पानी में पतला कर रहे हैं, तो एक दोहराने से चार quadrants 384 प्रारूप में एक ठोस अगर प्लेट (दाएं) पर मूल SGA थाली के रूप में एक ही पैटर्न में देखा जाता है (के रूप में रंग से संकेत). , 2,1 और 2,2 1,2: प्रक्रिया अन्य प्रतिकृति परीक्षण दोहराया जा सकता है. उदाहरण सही पर समय चूक छवियों 0.5, 2 और 3.5 दिनों के बाद टीका कब्जा कर लिया गया. पूरक 1 चित्रा 2 से अनुकूलित. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . / 018/4018fig2.jpg "> चित्रा 2. एक एकल रोबोट से कब्जा कर लिया QFA वृद्धि वक्र एक खमीर 20 पर अगर युक्त galactose पर बढ़ते तनाव के) QFA वृद्धि वक्र डिग्री सेल्सियस छवियाँ यन्त्र – मानव लगभग हर 2 घंटे कब्जा कर लिया गया. इस तापमान पर घातीय चरण में लगभग 1.5 दिनों के लिए नमूदार किया गया था, संस्कृति घनत्व में वृद्धि पहले से detectable टीका लगभग 2 दिनों के बाद बनने के साथ. एक सामान्यीकृत रसद मॉडल को मनाया डेटा (ग्रे वक्र) करने के लिए फिट था. कश्मीर ले जाने की क्षमता (एयू), आर (विकास दर (-1 घ)), जी (inoculum घनत्व (एयू)), (v विकास समरूपता): मॉडल QFA आर पैकेज द्वारा स्वचालित रूप से फिट मापदंडों प्रस्तुत कर रहे हैं. बी) के पैनल एक के लिए के रूप में, लॉग पैमाने पर सेल घनत्व के साथ साजिश रची है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . चित्रा 3. स्वचालित रूप से जीन दर्ज़ा दिया गया है विकास घटता 384 प्रारूप एक एकल थाली से समानांतर में कब्जा कर लिया प्रत्येक पैनल सेल घनत्व (लाल पार) का अनुमान है और जीन नाम या ओआरएफ y संख्या QFA प्रक्रिया में हो द्वारा लेबल स्वतंत्र संस्कृतियों के लिए मॉडल फिट (काला घटता) से पता चलता है. इस उदाहरण थाली रोबोट द्वारा imaged किया गया था और 20 डिग्री सेल्सियस पर एक स्वचालित इनक्यूबेटर में हो नाम प्लेट, थाली उपचार, अगर मध्यम और पुस्तकालय प्लेट संख्या: प्रयोगात्मक मेटाडाटा स्वतः आंकड़ा शीर्षक में शामिल हैं. फिट मॉडल पैरामीटर मान भी स्वतः एक पैनल पर मुद्रित कर रहे हैं (चित्र 2 देखें). एज संस्कृतियों QFA विश्लेषण से छीन लिया गया, इस साजिश में 308 संस्कृतियों (5.4 प्रोटोकॉल QFA देखें) को छोड़कर. के बाद से किनारे की संस्कृतियों QFA में नहीं विश्लेषण कर रहे हैं, इन संस्कृति स्थानों में आम तौर पर तटस्थ नियंत्रण उपभेदों (इस मामले में pGAL HIS3) के साथ भर रहे हैं. इस आंकड़े के मूल संस्करण, QFA आर पैकेज द्वारा उत्पादन, PDF प्रारूप में है. और इसलिए असीम से zoomable और पाठ प्रश्नों के द्वारा खोजा है./: Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "लक्ष्य =" _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 4. दो QFA स्क्रीन से fitnesses तुलना आनुवंशिक बातचीत परिणाम निकालना है. इस भूखंड के लिए नवोदित खमीर (yfgΔ) के विलोपन तटस्थ ura3Δ उत्परिवर्तन या तापमान संवेदनशील cdc13-1 उत्परिवर्तन के साथ संयुक्त और अर्द्ध अनुमोदक तापमान में वृद्धि हुई की फिटनेस की तुलना से पता चलता है cdc13 1 (27 डिग्री सेल्सियस). स्वास्थ्य अधिकतम दोहरीकरण दर और एक दोहरीकरण अधिकतम क्षमता के उत्पाद के रूप में गणना की गई. सबसे विलोपन उपभेदों अच्छी तरह से विकसित जब तटस्थ ura3Δ उत्परिवर्तन के साथ संयुक्त रूप में की उम्मीद है और उच्च फिटनेस है, लेकिन cdc13-1 के साथ संयुक्त के विलोपन fitnesses की एक विस्तृत श्रृंखला है. हल्के नीले रंग की लाइनों वें पर पारतटस्थ his3Δ उत्परिवर्तन की ई स्थान, ठोस लाइन आनुवंशिक आजादी के एक रेखीय प्रतिगमन मॉडल है (cdc13 – 1 की उम्मीद फिटनेस yfgΔ ura3Δ yfgΔ म्यूटेंट की फिटनेस को देखते म्यूटेंट) और धराशायी लाइन बराबर फिटनेस की लाइन है. विलोपन हरे रंग का काफी cdc13-1 उपभेदों की फिटनेस दोष में वृद्धि. विलोपन लाल रंग काफी एक ही दोष को दबाने. किसी भी cdc13-1 ठोस लाइन से उत्परिवर्तन yfgΔ के कार्यक्षेत्र दूरी प्लेट की शर्तों के तहत cdc13-1 और yfgΔ के बीच आनुवंशिक बातचीत की ताकत का संकेत है. ध्यान दें कि cdc13-1 के मजबूत दमन के कुछ शीर्ष सही पास पहले से कर रहे हैं जांच की चौकी जीन, DDC1 RAD17, और RAD24 और nuclease EXO1 के पहचान की. जीनों जिसका विलोपन फिटनेस को कम कर देता है (एन्कोडिंग डीएनए की मरम्मत और telomere Yku80 प्रोटीन कैपिंग) के पास YKU80 नीचे सही. यह भी ध्यान रखें कि जीन है कि एक साथ मिलकर कार्य के कुछ समूहों के इस भूखंड पर सह स्थित हो जाते हैं. तीन उदाहरण समूहों SPE1 नीले, SPE2 और SPE3 में डाला जाता है: spermidine जीन संश्लेषण, RAD17, DDC1 और RAD24: चौकी फिसलने दबाना और चौकी दबाना लोडर, Mre11, RAD50 और XRS2 एन्कोडिंग घटकों: MRX जटिल, DDR और EST1 में शामिल और EST3: जीन telomere लंबाई विनियमन में शामिल किया गया. पूरक चित्रा 1 1B से अनुकूलित, कच्चे डेटा है जो इस साजिश से उत्पन्न किया गया यहाँ से डाउनलोड किया जा सकता है: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . "> फ़ाइल आईडी फ़ाइल प्रकार मैन्युअल निर्माण फ़्रिक्वेंसी अद्यतन शर्त FT1 प्लेट फोटोग्राफ नहीं प्लेट और timepoint प्रति हां Ft2 प्रयोगात्मक विवरण हां प्रयोग प्रति हां FT3 पुस्तकालय विवरण हां पुस्तकालय प्रति हां FT4 मानक जीन नाम हां पुस्तकालय प्रति नहीं FT5 Colonyzer ouput नहीं प्लेट प्रति timepoint प्रति हां FT6 QFA कच्चे डेटा नहीं प्रयोग प्रति – FT7 <tघ> QFA, उपस्कर पैरामीटर नहीं प्रयोग प्रति – FT8 QFA स्वास्थ्य सारांश नहीं प्रयोग प्रति – FT9 QFA जेनेटिक सहभागिता हिट – लिस्ट नहीं जीआईएस अध्ययन के अनुसार (2 expts.) – तालिका 1 इलेक्ट्रॉनिक QFA फ़ाइलें. सभी सूचीबद्ध फ़ाइलें (FT1 छोड़कर) टैब – सीमांकित पाठ फ़ाइलें हैं और निर्माण किया जा सकता है या किसी भी पाठ संपादक या स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पढ़ा. निर्माण QFA मेटाडेटा फ़ाइलों और QFA उत्पादन की सटीक व्याख्या के बारे में अधिक जानकारी के लिए कृपया QFA आर पैकेज 7 प्रलेखन और Colonyzer के सॉफ्टवेयर 3 प्रलेखन देखें. तालिका 2. संस्कृति फिटनेस का आकलन करने के लिए तरीके. विशेषताओं का एक सारांश और आवश्यकतामाइक्रोबियल संस्कृति फिटनेस का आकलन करने के लिए तरीकों की एक संख्या के बयान. 8 Blomberg द्वारा एक समीक्षा इनमें से कुछ अधिक विस्तृत तुलना में शामिल है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

Discussion

QFA कई होश में प्रत्यक्ष तीन स्थापित सूक्ष्मजीवविज्ञानी बेंच पैमाने पर तकनीक के वंशज: संस्कृति कमजोर पड़ने श्रृंखला हाजिर ⁹ परीक्षण, विकास हैं वातित तरल ⁹ संस्कृतियों और प्रतिकृति चढ़ाना ¹³ में वक्र दृढ़ संकल्प है. इन तीन तरीकों संक्षेप और QFA और तालिका 2 में अन्य उच्च throughput तकनीक के साथ तुलना कर रहे हैं. जबकि कमजोर पड़ने श्रृंखला स्थान परीक्षण इसके inoculum dilutions की एक सीमा से हो संस्कृतियों की एक श्रृंखला में कालोनियों के रूप में करने की क्षमता के रूप में एक तनाव फिटनेस को परिभाषित करने के लिए, एक ही संस्कृति के दोहराया टिप्पणियों के द्वारा QFA उपायों तनाव फिटनेस विकास वक्र का निर्माण. एकल संस्कृतियों से फिटनेस बढ़ाता अधिक कई उपभेदों के साथ जांच करने के लिए समान शर्तों के तहत, अनुमति देता है. संस्कृतियों की नकल arrays तनाव संग्रह, सबसे उपयोगी दोहराया परीक्षण की अनुमति देता है जब संस्कृति अंतर के लिए अलग अलग वातावरण या आनुवंशिक पृष्ठभूमि में फिटनेस परीक्षण. QFA प्रोटोकॉल प्रस्तुतयहाँ महंगा रोबोट उपकरण का उपयोग करता है को दोहराने के लिए, टीका लगाना, सेते हैं और छवि अगर प्लेटों, स्वतंत्र संस्कृतियों (QFA रोबोट, तालिका 2) के हजारों के विकास के अवलोकन के लिए उपयुक्त है. हालांकि, के बाद से QFA की स्थापना की, परंपरागत प्रयोगशाला तकनीकों पर आधारित है, यह भी बाहर किया जा सकता है बहुत अधिक सस्ते मैनुअल के चरणों का (पुस्तिका QFA, तालिका 2) के साथ रोबोट सहायता की जगह द्वारा. पुस्तिका QFA और अगर प्लेट पर संस्कृतियों पुस्तिका पिन उपकरण और करने के लिए और फोटोग्राफी के लिए एक मशीन से प्लेटों के मैनुअल हस्तांतरण का उपयोग कर की प्रतिकृति टीका शामिल है. एक ही कम्प्यूटेशनल विश्लेषण कार्यप्रवाह या तो प्रयोगात्मक डिजाइन से विकास घटता उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है.

QFA फिटनेस के अनुमानों के अपेक्षाकृत सटीक होने लगते हैं. चित्रा 4 में कार्यात्मक संबंधित जीन विलोपन के चार उदाहरण समूहों का मतलब fitnesses डाला जाता है. दो independ में प्रत्येक कार्यात्मक संबंधित जीन वर्ग के सदस्यों के करीब निकटताईएनटी आनुवंशिक पृष्ठभूमि (ura3Δ और cdc13-1) QFA फिटनेस अनुमान के reproducibility इंगित करता है. उदाहरण के लिए, केवल 3 जीन विलोपन (बाहर एक संभव 4300) संरक्षित MRX परिसर के तीन सदस्यों को अलग.

माइक्रोबियल उपभेदों के विकास विशेषताओं का परीक्षण करने के लिए उच्च throughput QFA के लिए विकल्प SGA ^5,6, में barcoded पुस्तकालयों में प्रतिस्पर्धा ^11,12 स्क्रीन और स्क्रीन spectrophotometric प्लेट पाठकों में ऑप्टिकल घनत्व कैनेटीक्स पर कब्जा शामिल हैं ¹⁰ जो तालिका 2 में संक्षेप हैं और अधिक पूरी तरह से ⁸ कहीं वर्णित . QFA और SGA प्लेटें, जहां संस्कृतियों ठोस अगर सतहों (अगर आधारित विधियों, तालिका 2) बढ़ने पर रोबोट द्वारा जल्दी और आसानी से संभाला जा सकता है. ठोस अगर सतह संस्कृतियों को अच्छी तरह से विकास भर में वातित रहे हैं और कोशिकाओं निश्चित संस्कृतियों में, मिलनसार रोगाणुओं एक ¹⁴ समुदाय में विकसित करने के लिए बढ़ने की अनुमति दे सकते हैं. वाम बरकरार, माइक्रोबियल समुदायोंअपने स्वयं के सूक्ष्म वातावरण, इथेनॉल जैसे स्रावित विषाक्त पदार्थों, और संभवतः कोशिकाओं के बीच संकेतन ffect. हालांकि, निरंतर पर्याप्त वातन प्राप्त करने के लिए आवश्यक तरल संस्कृतियों का मिश्रण है, कृत्रिम रूप से सूक्ष्म समुदायों और उनके सूक्ष्म वातावरण है जो उनके विकास के मोड को प्रभावित कर सकता है बाधित. पार संदूषण ठोस अगर तरीकों में एक चिंता का कम है के बाद से वहाँ तरल संस्कृतियों के बीच कोशिकाओं को ले जाने की बौछार के लिए कम अवसर है. यदि संदूषण ठोस अगर assays में विदेशी हवा वहन रोगाणुओं द्वारा होता है, यह अक्सर ठोस अगर प्लेटों के दृश्य निरीक्षण से पता लगाया जा सकता है और के लिए जिम्मेदार है या हटा दिया.

QFA throughput के दो मायनों में समानांतर तरल तरीकों की तुलना में काफी अधिक है. सब से पहले, QFA प्लेट (और SGA) पर टीका संस्कृतियों को एक साथ पैक कर रहे हैं अधिक घनी, प्लेट प्रति अधिक स्वतंत्र संस्कृतियों दे रही है. QFA में आम तौर पर कर रहे हैं 308 संस्कृतियों, गैर प्रयोगात्मक धार (चित्रा 1) संस्कृतियों कॉम गिनती नहीं96 या 100 प्रति प्लेट संस्कृतियों के साथ तरल संस्कृतियों समानांतर मुकाबले. दूसरे, QFA प्रयोगों प्लेटों की एक बहुत बड़ी संख्या को बढ़ाया जा सकता है. जबकि एक एकल QFA प्रयोग में विश्लेषण प्लेटों की संख्या केवल एक मशीन या गर्म कमरे, न्यूनतम स्वीकार्य छवि पर कब्जा आवृत्ति और अधिकतम प्राप्त कब्जा आवृत्ति में उपलब्ध स्थान के द्वारा सीमित है, एक तरल विकास प्रयोग में प्लेटों की संख्या दृढ़ता से सीमित है प्लेट पाठक (आमतौर पर एक या दो प्लेट), या प्लेट पाठक (आम तौर पर 25-50 प्लेट) से जुड़ी स्टेकर की क्षमता के द्वारा. हमने हाल ही में 123 प्लेटें, प्रत्येक पर 308 प्रयोगात्मक संस्कृतियों के साथ एक पूरी तरह से स्वचालित QFA प्रयोग किया है, 37,884 युगपत संस्कृतियों दे. अनुमान है कि हम स्वतंत्र तरल में बढ़ती संस्कृतियों की अधिकतम प्राप्त संख्या 96 (संस्कृतियों थाली /) है एक्स (प्लेटें स्टेकर /) 50 +४,८०० =, जो दस हमारे QFA throughput के तुलना में कम गुना के आसपास है. तरल संस्कृति स्क्रीन के लिए एक वैकल्पिक करने के लिए कई स्वचालित gro के उपयोगसमानांतर में wth उपकरणों ⁽⁸ Blomberg से समीक्षा से तालिका 1), प्रत्येक एक या दो प्लेटों की क्षमता वाले. प्रत्येक डिवाइस में तापमान नियंत्रण स्वतंत्र है, और इसलिए शर्तों समान नहीं हैं, लेकिन यह सोचते हैं कि वे कर रहे हैं, इस वर्कफ़्लो के 190 कम से कम इस तरह के उपकरणों (डिवाइस प्रति 200 तरल संस्कृतियों संभालने) QFA throughput के मैच के लिए की आवश्यकता होगी.

सारांश में, QFA उच्च गुणवत्ता वाले एक कार्यप्रवाह है कि उपयोगी दोनों छोटे पैमाने पर ध्यान केंद्रित प्रयोगों और उच्च throughput स्क्रीन में मात्रात्मक विकास phenotypes इकट्ठा करने के लिए लागू कर सकते हैं. यह काफी लचीला रोबोट उपकरणों के लिए आवश्यकताओं के साथ अलग को प्रभावी ढंग से लागू किया जाना है. QFA वर्कफ़्लो के कम्प्यूटेशनल घटक मुक्त रूप से उपलब्ध है, खुला स्रोत कोड पर आधारित है.

Materials

Name of reagent/equipment	Company	Catalogue number	Comments
Replica Plater	Sigma	R-2508	96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins
Mix Mate	Eppendorf	5353 000.014
Biomek FX	Beckman	A31842
Teleshake	Thermo Scientific	50095890	Installed on Biomek FX
BM3-SC	S&P Robotics Inc	BM3-SC	192 shelf rotating carousel
spImager	S&P Robotics Inc	spImager	High resolution manual imaging
spImager with Cytomat	S&P Robotics Inc	Custom	Temperature controlled automated high resolution imaging
Cytomat 6001 with heat exchanger	Thermo Scientific	51022222	Attached to spImager
Ecoline RE207	Lauda	RE207	Attached to Cytomat
spImager with carousel	S&P Robotics Inc	Custom	Automated high resolution imaging
Robot pin tool fixture for FP12pins	V&P Scientific	AFIX96FP12	N/A
96 x FP12 pins	V&P Scientific	FP12	50.4 mm long, 17 mm exposed pin length
Docking Station for Pin Tool	V&P Scientific	VP425	Docking station base removed to allow fan drying of pins
Pin Cleaning Brush	V&P Scientific	VP425	N/A
Replica Plater	Sigma	R-2508	Manual pin tool
Nunc OmniTray with Lid	Nunc	734-0490	N/A
96 well sterile polystyrene plates	Greiner BioOne	655161	N/A
96 well sterile polystyrene lids	Greiner BioOne	656171	N/A

Table 3. Specific reagents and equipment.