Kvantitative Fitness Analyse (QFA) er en supplerende serie af eksperimentelle og beregningsmæssige metoder til estimering af mikrobielle kultur fitnesses. QFA estimerer effekten af genetiske mutationer, lægemidler eller andre anvendte behandlinger for mikrobe vækst. Forsøgene skalering af fokuserede analyse af enkelte kulturer til tusindvis af parallelle kulturer kan udformes.
Kvantitative Fitness Analyse (QFA) er en eksperimenterende og beregningsmæssige workflow til at sammenligne fitnesses af mikrobielle kulturer dyrket i parallel 1,2,3,4. QFA kan anvendes til fokuserede observationer af enkelte kulturer, men er mest nyttig for genom-dækkende genetiske interaktion eller narkotika skærme undersøge op til tusindvis af uafhængige kulturer. Den centrale eksperimentelle fremgangsmåde er inokulering af uafhængige, fortyndede flydende mikrobielle kulturer på faste agarplader, som blev inkuberet og regelmæssigt fotograferet. Billeder fra hvert tidspunkt analyseres, producerer kvantitative celledensitet estimater, som anvendes til at konstruere vækstkurver, så kvantitative fitness der skal udledes. Kultur fitnesses kan sammenlignes med kvantificere og rangordne genetiske interaktion styrker eller narkotika følsomhed. Effekten på kultur egnethed af eventuelle behandlinger tilføjet i underlaget agar (fx små molekyler, antibiotika eller næringsstoffer) eller anvendes på plader eksternly (f.eks UV-bestråling, temperatur) kan kvantificeres ved QFA.
Den QFA arbejdsgang fremstiller væksthastighed anslår analoge til dem opnået ved spektrofotometrisk måling af parallelle flydende kulturer i 96-brønds eller 200-brøndplade læsere. Vigtigt, QFA har signifikant højere gennemløb sammenlignet med sådanne fremgangsmåder. QFA kulturer vokse på en fast agaroverfladen og er derfor godt beluftet under vækst uden behov for omrøring eller omrystning.
QFA throughput er ikke så høj som for nogle syntetiske Genetisk Array (SGA) screeningsmetoder 5,6. Men da QFA kulturer er stærkt fortyndet, før de podet på agar, kan QFA fange mere komplette vækstkurver, herunder eksponentiel og farvemætning fase 3. For eksempel giver vækstkurven observationer kultur fordoblingstider skal estimeres direkte med høj præcision, som diskuteret tidligere 1.
Her præsenterer vi enspecifik QFA protokol anvendes til tusindvis af S. cerevisiae kulturer, der håndteres automatisk af robotter i løbet af podning, inkubation og billedbehandling. Enhver af disse automatiserede trin kan erstattes af en tilsvarende, manuel procedure, med en tilhørende reduktion i gennemløb, og vi også præsentere en lavere overførselshastighed manuel protokol. De samme QFA softwareværktøjer kan anvendes på billeder taget i enten arbejdsgang.
Vi har stor erfaring gælder QFA til kulturer af den spirende gær S. cerevisiae, men vi forventer, at QFA vil vise sig lige så nyttig for behandlingen kulturer fission gær S. pombe og bakteriekulturer.
QFA er på mange måder en direkte efterkommer af tre etablerede bench-skala mikrobiologiske teknikker: kultur fortyndingsrække stikprøver 9, vækstkurven bestemmelse i vand tilsat flydende kulturer 9 og replikaudpladning 13. Disse tre fremgangsmåder er opsummeret og sammenlignet med QFA og andre højt gennemløb teknikker i tabel 2. Ud fra følgende betragtninger fortyndingsrække stikprøver definerer en stamme egnethed som sin evne til at danne kolonier i en serie af kulturer dyrket fra en række af inokulum fortyndinger, at QFA foranstaltninger belastning fitness ved gentagne observationer af en enkelt kultur konstruere en vækstkurve. Kvantificering fitness fra enkelte kulturer giver mange flere stammer, der skal undersøges samtidigt, under identiske betingelser. Replikerende arrays af kulturer tillader gentagne test af stamme samlinger, mest nyttig ved test for kultur fitness forskelle i forskellige miljøer eller genetiske baggrunde. Den QFA protokol præsenteretHer anvender kostbart robotudstyr til at replikere, inokulere, inkuberes og billeddata agarplader, passende for at observere vækst af tusinder af uafhængige kulturer (robot QFA, tabel 2). Men da QFA bygger på etablerede, traditionelle laboratorieteknikker, kan det også udføres langt billigere ved at erstatte robot bistand i forbindelse med manuelle trin (manuel QFA, tabel 2). Manuel QFA indebærer replikation og podning af kulturer på agarplader ved hjælp af en manuel pin værktøj og manuel overførsel af plader til og fra en inkubator til fotografering. Den samme Computeranalyse arbejdsgang kan anvendes til at generere vækstkurverne fra begge eksperimentelle design.
QFA fitness estimater synes at være forholdsvis præcist. I figur 4 er de gennemsnitlige fitnesses fire eksempel klynger af funktionelt beslægtede gendeletioner fremhævet. Nærheden af medlemmer af hvert funktionelt relateret gen klasse i to uafskellige genetiske baggrunde (ura3Δ og CDC13-1) angiver reproducerbarheden af QFA fitness skøn. For eksempel adskiller kun 3 gendeletioner (ud af en mulig 4300) tre medlemmer af den konserverede MRX komplekset.
High-throughput alternativer til QFA for afprøvning vækstkarakteristika af mikrobielle stammer indbefatter SGA 5,6, konkurrence skærme i stregkodede biblioteker 11,12 og skærme indfangningsproceduren optiske densitet kinetik i spektrofotometriske plade læser 10, der er opsummeret i tabel 2 og er beskrevet mere fuldstændigt andetsteds 8 . QFA og SGA plader, hvor kulturer vokser på fast agar overflader (agar-baserede metoder, tabel 2) kan håndteres hurtigt og nemt med robot. Solid agaroverfladen kulturer er godt beluftet hele vækst og celler kan vokse i faste kulturer, så omgængelig mikrober til at vokse i et fællesskab 14. Efterlades intakt, mikrobielle samfund etffect deres mikromiljøer og secernerer toksiner såsom ethanol, og eventuelt signalering mellem celler. Men kontinuerlig blanding af flydende kulturer, der er nødvendige for at opnå tilstrækkelig beluftning, kunstigt forstyrrer mikrobielle samfund og deres mikro-miljøer, som kan påvirke deres former for vækst. Krydskontaminering er et mindre problem i fast agar metoder, da der er mindre mulighed for væskesprøjt bærende celler mellem kulturer. Hvis kontaminering forekommer ved fremmede luftbårne mikroorganismer i fast agar-assays, kan det ofte kan detekteres ved visuel inspektion af faste agarplader og udgjorde eller fjernes.
QFA gennemløb er betydeligt højere end parallelle flydende metoder på to måder. Først og fremmest, om QFA (og SGA) plader, der er podede kulturer pakkes sammen mere tæt, hvilket giver flere uafhængige kulturer per plade. I QFA er der typisk 308 kulturer, ikke tælle ikke-eksperimentelle kant kulturer (fig. 1) KOMforhold til parallelt flydende kulturer med 96 eller 100 kulturer per plade. For det andet kan QFA eksperimenter skaleres til en meget større antal plader. Medens antallet af plader blev analyseret i et enkelt QFA eksperiment er kun begrænset af den tilgængelige plads i en inkubator eller varmt rum, den mindste tilladelige billedoptagelse frekvens og den maksimalt opnåelige indfangning frekvens, antallet af plader i en væske vækst eksperiment er stærkt begrænset ved evnen af pladelæser (typisk en eller to plader), eller af stabler fastgjort til pladelæser (typisk 25-50 plader). Vi har for nylig gennemført en fuldt automatiseret QFA eksperiment på 123 plader, hver med 308 eksperimentelle kulturer, hvilket giver 37,884 samtidige kulturer. Vi vurderer, at det maksimalt opnåelige antal selvstændige kulturer, der vokser i væsken er 96 (kulturer / plade) x 50 (plader / stabler) = 4800, hvilket er omkring ti gange mindre end vores QFA gennemløb. En alternativ til flydende kultur skærme er at anvende mange automatiserede groWth enheder parallelt (tabel 1 fra gennemgangen af Blomberg 8), der hver har en kapacitet på en eller to plader. Temperatur kontrol i hver enhed er uafhængig, og det forhold er ikke identiske, men forudsat at de er, ville denne arbejdsproces kræver mindst 190 sådanne anordninger til at matche QFA gennemløb (under forudsætning af 200 flydende kulturer pr enhed).
Sammenfattende er QFA en høj kvalitet arbejdsgang, der med fordel kan anvendes til at indsamle kvantitative vækst fænotyper i både små skala fokuserede eksperimenter og high-throughput skærme. Den er fleksibel nok til at blive anvendt effektivt med varierende krav til robotudstyr. Den beregningsmæssige del af QFA arbejdsgangen er baseret på frit tilgængelige, open source-kode.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker for alle medlemmer af vores laboratorium og Center for Integreret Systembiologi af aldring og ernæring (CISBAN) for støtte og nyttige diskussioner. Denne undersøgelse blev støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) og Wellcome Trust (075.294, 093.088).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.