Подготовка T фактор роста клеток от Крыса Спленоциты
Summary
Мы описываем подготовки Т-клеток фактор роста для в пробирке расширения антиген-специфических Т-лимфоцитов крыс линии.
Abstract
Поддержание антиген-специфических Т-клеток линий или клонов в культуре требует раундов антиген-индуцированной активации разделенных фаз клеточного 1,2 экспансии. Добавление интерлейкина-2 в культуре средств массовой информации во время фазы расширения необходимо предотвратить гибель клеток и достаточно для поддержания краткосрочной линии Т-клеток, но было показано, что увеличение Th1 поляризации 3. Замена интерлейкин 2, Т-клеточный фактор роста (TCGF), который содержит смесь цитокинов является более эффективным, чем интерлейкина-2 в поддержании долгосрочной линии Т-клеток в пробирке 3. Более того, TCGF могут быть легко получены в больших количествах в лаборатории и намного дешевле, чем рекомбинантный интерлейкин 2.
Здесь мы покажем, как готовить TCGF от крыс спленоцитов супернатантах культуры. Для этой процедуры, жмем селезенки от наивных крыс Льюиса эвтаназии для тимуса и сбора крови. Мы готовим одноклеточных суспензий из селезенки, лизировать эритроциты от осмотического шока, и семян спленоцитов в культуральной среде. Клетки стимулировали конканавалин, митоген, что не-выборочно активирует все лимфоцитов крыс T, вызывая продукцию цитокинов. Культуры supernantant собирается через 48 часов andexcess конканавалин связан с альфа-метил mannoside, чтобы предотвратить его активации Т клеточных линий на которых TCGF будет добавлен. TCGF затем стерильно фильтруют, аликвоты и хранили при температуре -20 ° C.
Protocol
Discussion
Мы готовим TCGF из спленоцитов крыс Льюиса, так как мы регулярно эвтаназии наивные крыс от этого штамма для сбора сыворотки и thymi стимулировать Льюис крыс линии Т-клеток в пробирке. Это TCGF может быть использована для поощрения роста и выживания Т клеточных линий из других штаммов крысы. TCGF также могу?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS, 1x, sterile | Reagent | Gibco / Invitrogen | 14040-182 | |
| Penicillin / Streptomycin 100x | Reagent | Sigma | P0781 | Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS |
| Cell strainer, 70 um diameter | Tool | Fisher | 08-771-2 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Reagent | Sigma | A0171 | Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold |
| RPMI 1640 | Reagent | Gibco / Invitrogen | 21870-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) | Reagent | Gibco / Invitrogen | 16140-071 | Heat-inactivated |
| Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine | Reagent | Cambrex / Biowhittaker | 17-718R | PSG |
| RPMI vitamins, 100x | Reagent | Sigma | R7256 | |
| Sodium pyruvate, 100x | Reagent | Sigma | S8636 | |
| Non-essential amino acids, 100x | Reagent | Sigma | ||
| Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7522 | |
| alpha methyl mannoside | Reagent | Sigma | M6882 | |
| Concanavalin A | Reagent | Sigma | M6882 |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -. M., Gola, M., Sabatier, J. -. M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
