Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em> In-vitro-</em> Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA
Summary
Eine Technik zur translationalen Pause Sites auf mRNA zu identifizieren beschrieben wird. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide ansammeln auf Ribosomen während der in vitro Translation einer Ziel-mRNA, durch die Größe Analyse der naszierenden Ketten mit Hilfe eines denaturierenden Gelelektrophorese gefolgt basiert.
Abstract
Die Geschwindigkeit der Translationselongation ungleichmäßig ist. Sekundärstruktur der mRNA, mRNA-Codon-Nutzung und assoziierten Proteinen kann Ribosom Bewegung auf die Meldung zur Prüfung zu verändern siehe 1. Allerdings ist es nun weitgehend akzeptiert, dass ein Synonym Codonverwendung die primäre Ursache für ungleichmäßige Translationselongation Sätze 1 ist. Synonyme Codons sind nicht mit gleicher Frequenz verwendet. Eine Vorspannung besteht in der Verwendung von synonymen Codons mit Codons einigen häufiger als andere 2 verwendet. Codon-Bias ist Organismus als auch gewebespezifische 2,3. Darüber hinaus ist die Frequenz der Codonverwendung direkt proportional zu den Konzentrationen von verwandten tRNAs 4. Somit wird ein häufigsten verwendeten Codons höhere Vielzahl von entsprechenden tRNAs, die impliziert, dass ein häufiges Codon schneller als einem seltenen wird man übersetzt werden. So werden die Regionen auf mRNA in seltenen Codons (potentiellen Pause Sites) angereichert in der Regel langsamer Bewegung auf dem Ribosom MessaGE und Ursache entstehende Anhäufung von Peptiden der jeweiligen Größen 5-8. Diese Pause Standorte können funktionelle Auswirkungen auf die Protein-Expression haben, finden die mRNA-Stabilität und Faltung von Proteinen für die Überprüfung 9. Tatsächlich wurde gezeigt, dass eine Senkung der solche Pause-Seiten können Ribosom Bewegung auf mRNA verändern und anschließend kann die Effizienz der Co-translationale (in vivo) Proteinfaltung 1,7,10,11 beeinflussen. Um den Prozess der Proteinfaltung in vivo zu verstehen, in der Zelle, die letztlich auf den Prozess der Protein-Synthese ist es wichtig, umfassende Einblicke in die Auswirkungen der Codon-Nutzung / tRNA-Inhalte auf die Bewegung entlang der Ribosomen-mRNA gewinnen während Translationselongation gekoppelt .
Hier beschreiben wir eine einfache Technik, die zur großen Pause Übersetzung Standorte für eine bestimmte mRNA in verschiedenen zellfreien Systemen 6-8 übersetzt zu lokalisieren. Dieses Verfahren beruht auf der Trennung entstehenden Polypeptide accumulati Basisng an Ribosomen während der in vitro Translation eines Target-mRNA. Der Grund ist, dass bei niedrigen Frequenzen Codons, die Erhöhung der Verweilzeit der Ribosomen führt zu einer erhöhten Mengen von naszierendem Peptide der entsprechenden Größe. In-vitro-transkribierte mRNA wurde in vitro Translations-Reaktionen in Gegenwart von radioaktiv markierten Aminosäuren die Detektion der naszierenden Ketten zu ermöglichen. Um Ribosom gebundenen Komplexe entstehenden Polypeptid zu isolieren die Übersetzung Reaktion auf von 30% Glycerin-Lösung geschichtet, gefolgt von Zentrifugation. Nascent Polypeptide in polysomaler Pellets werden weiter mit Ribonuklease A behandelt und durch SDS-PAGE. Diese Technik kann für jedes Protein potentiell verwendet werden und ermöglicht die Analyse der Bewegung entlang Ribosom-mRNA und der Nachweis der größten Pause Seiten. Zusätzlich kann dieses Protokoll angepasst, um Faktoren und Bedingungen, die Ribosomen-Bewegung zu verändern und damit potentiell auch verändern th studieren werdene-Funktion / Konformation des Proteins.
Protocol
Discussion
Für reproduzierbare Ergebnisse, Qualität und Konzentration der Komponenten für die in vitro Transkription und Translation-Reaktionen verwendet kritisch sind. In der aktuellen Studie haben wir kommerziell verfügbaren Kits und Extrakte, die in hohem Maße reproduzierbar Daten zu liefern, bei sorgfältiger Behandlung eingesetzt. Jedoch kann die Übersetzung-zuständigen Extrakte aus der Zelle des eigenen Wahl hergestellt werden, wenn nötig. Qualität der mRNA kann die Translation beeinflussen, so ist es von g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Human Frontier Science Program RGP0024 Zuschuss finanziert.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
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