Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em> In vitro</em> Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA
Summary
Una tecnica per identificare i siti di pausa traslabile su mRNA viene descritto. Questa procedura è basata su isolamento di polipeptidi nascenti accumulano sui ribosomi durante traduzione in vitro di un mRNA bersaglio, seguita dall'analisi dimensione delle catene nascenti elettroforesi utilizzando un gel denaturante.
Abstract
Il tasso di allungamento traslazionale è non uniforme. mRNA struttura secondaria, l'uso codone mRNA e proteine associate possono alterare il movimento ribosoma sul messaggio per una rassegna vedi 1. Tuttavia, è ormai ampiamente riconosciuto che l'utilizzo codone sinonimo è la causa primaria di non-uniformi tassi di allungamento traslazionali 1. Codoni sinonimo non vengono utilizzati con frequenza identica. Una polarizzazione esiste l'uso di codoni sinonimo con alcuni codoni usati più frequentemente di altri 2. Codone bias è organismo così come tessuto specifico 2,3. Inoltre, la frequenza di uso dei codoni è direttamente proporzionale alla concentrazione delle affine tRNA 4. Così, un codone frequentemente usato avrà maggiore moltitudine di tRNA corrispondenti, implicando che un codone di frequente si tradurrà più velocemente di un infrequente uno. Così, regioni mRNA arricchito in codoni rari (siti pausa potenziali) saranno di regola rallentare il movimento del ribosoma Message e causa l'accumulo di peptidi nascenti delle rispettive dimensioni 5-8. Questi siti di pausa può avere un impatto funzionale l'espressione della proteina, la stabilità mRNA e folding delle proteine per una rassegna vedi 9. Infatti, è stato dimostrato che la riduzione di tali siti di pausa può alterare il movimento ribosoma mRNA e successivamente possono influenzare l'efficienza di co-traduzionale (in vivo) 1,7,10,11 ripiegamento delle proteine. Per comprendere il processo di ripiegamento delle proteine in vivo, nella cella, che è accoppiato alla fine al processo di sintesi proteica è essenziale di acquisire informazioni complete sull'impatto codone di utilizzo / tRNA contenuto sul movimento dei ribosomi lungo mRNA durante l'allungamento traslazionale .
Qui si descrive una tecnica semplice che può essere utilizzata per localizzare siti di traduzione principali pausa per un dato mRNA tradotto in vari sistemi acellulari 6-8. Tale procedura si basa sull'isolamento del nascente polipeptidi accumulating sui ribosomi durante la traduzione in vitro di un mRNA bersaglio. La ragione è che a bassa frequenza codoni, l'aumento del tempo di residenza dei risultati ribosomi in quantità maggiore di peptidi nascenti delle dimensioni corrispondenti. In vitro mRNA trascritti viene utilizzato per reazioni di traslazione in vitro in presenza di amminoacidi marcati radioattivamente per consentire il rilevamento delle catene nascenti. Al fine di isolare ribosoma associazione complessi polipeptide nascente la reazione di traduzione è sovrapposto di soluzione di glicerolo 30% seguito da centrifugazione. Polipeptidi nascenti in polysomal pellet sono ulteriormente trattati con ribonucleasi A e risolti mediante SDS PAGE. Questa tecnica può essere potenzialmente utilizzati per ogni proteina e permette l'analisi di movimento ribosoma lungo mRNA e la rilevazione dei siti di pausa principali. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per studiare fattori e condizioni che possono alterare il movimento ribosoma e quindi potenzialmente possono anche alterare the funzione / conformazione della proteina.
Protocol
Discussion
Per risultati riproducibili, la qualità e la concentrazione dei componenti utilizzati per la trascrizione in vitro e le reazioni di traduzione sono critiche. In questo studio abbiamo usato i kit disponibili in commercio e gli estratti che forniscono dati altamente riproducibili, se maneggiato con cura. Tuttavia, traduzione-competenti estratti possono essere preparati dalla cella di propria scelta, se necessario. Qualità di mRNA può influenzare la traduzione, quindi è della massima importanza per testare l&#…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal programma Human Frontier Science concessione RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
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