リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em> in vitroで</em> mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために
Summary
mRNA上の翻訳停止部位を同定する技術が記載されている。この手順は、変性ゲル電気泳動を用いた初期のチェーンの大きさの分析に続いて標的mRNAのin vitro翻訳、イン時にリボソーム上で蓄積新生ポリペプチドの分離に基づいています。
Abstract
翻訳伸長率は、非均一である。二次構造、コドン使用頻度をmRNAと1を参照して 、関連するタンパク質はレビューのためにメッセージにリボソームの動きを変更することがmRNAを。しかし、現在広く同義コドンの使用率が不均一な翻訳伸長率が1の主な原因であることを受け入れている。同義コドンは、同一の周波数で使用されていません。バイアスは、他の2よりも頻繁に使用されるいくつかのコドンを同義コドンの使用に存在しています。コドンバイアスは、生物と同様に2,3 –特定の組織である。また、コドンの使用頻度は、同族のtRNA 4の濃度に直接比例します。したがって、頻繁に使用されるコドンは、さらに頻繁なコドンが速くまれなものよりも翻訳されることを意味し、対応するtRNAの高い多数を持っています。したがって、使用頻度の低いコドン（潜在的な休止サイト）に富んでmRNA上の領域は、原則としてミサにリボソームの動きが遅くなりますそれぞれのサイズ5-8の新生ペプチドのGEの原因と蓄積。これらのポーズのサイトはレビューのために機能的なタンパク質の発現に及ぼす影響は、mRNAの安定性とタンパク質の折りたたみを持っている9を参照することができます。確かに、そのようなポーズサイトの緩和は、mRNAにリボソームの動きを変更することができ、その後、共同翻訳（ インビボ ）タンパク質のフォールディング1,7,10,11の効率に影響を与える可能性があることが示された。最終的には翻訳伸長中のmRNAに沿ってリボソームの移動に関するコドン使用頻度/ tRNAのコンテンツの影響に包括的な洞察を得ることが不可欠であるタンパク質合成のプロセスに結合されている細胞で、 生体内でのタンパク質の折り畳み過程を理解するために、 。
ここでは、様々な無細胞系6-8に翻訳与えられたmRNAの主要な翻訳停止部位を見つけるために使用することができる簡単なテクニックについて説明します。この手順は、新生ポリペプチドaccumulatiの分離に基づいています標的mRNAのin vitro翻訳中のリボソーム上でNG。根拠は、低周波のコドンでは、対応するサイズの新生ペプチドの増加量のリボソーム結果の滞留時間の増加が。in vitroで転写されたmRNA には放射性標識アミノ酸の存在下でin vitroでの翻訳反応に使用されていることです。新生鎖の検出を可能にします。リボソーム結合した新生ポリペプチド複合体を単離するために翻訳反応は、遠心分離に続いて、30％グリセロール溶液の上に階層化されています。ポリソームペレットの新生ポリペプチドはさらにリボヌクレアーゼで処理し、SDS PAGEで解決されます。このテクニックは、潜在的に任意のタンパク質で使用され、リボソームのmRNAに沿って動き、主要な休止部位の検出の分析を可能にすることができます。さらに、このプロトコルは、リボソームの動きを変えることができるので、潜在的にも目を変えることができる要素や条件を研究するために適応させることができます電子機能/タンパク質のコンフォメーション。
Protocol
Discussion
再現可能な結果を得るためには、in vitro転写·翻訳反応に使用されるコンポーネントの品質と濃度が非常に重要です。現在の研究では、慎重に処理した場合、再現性の高いデータを提供する市販のキット及び抽出物を使用しています。ただし、必要であれば、翻訳、有能な抽出物は、自分の選択した細胞から調製することができる。 mRNAの品質は翻訳に影響を与えることがないの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム助成RGP0024によって資金を供給された。
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
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