mRNA의 translational 일시 사이트를 식별하는 기술은 설명되어 있습니다. 이 절차는 denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 초기 체인의 크기를 분석하여 다음 타겟 mRNA의 체외 번역의 도중에 변이를 축적 초기 polypeptides의 분리에 근거한다.
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이 논문에서
요약
초록
translational 신장의 속도가 아닌 교복이다. 이차 구조, 코돈 사용을 mRNA와 1 참조 관련 단백질 검토를 위해 메시지에 ribosome 운동을 변경할 수도 있습니다 mRNA. 그러나 이제는 널리 동의어 코돈 사용하는 비 균일한 translational 신장 속도 1 차 원인임을 인정있어. 동의어 codons는 동일한 주파수로 사용되지 않습니다. 바이어스가 다른이보다 더 자주 사용하는 일부 codons와 동의어 codons의 사용에 있습니다. 코돈 바이어스는 유기체뿐만 아니라 2,3 구체적인 조직이다. 또한 코돈 사용 빈도가 기원 tRNAs 4의 농도에 직접 비례합니다. 따라서 자주 사용하는 코돈은 더 자주 코돈이 빠르게 드문보다 번역된다는 것을 의미합니다 해당 tRNAs 높은 무리를 가질 것입니다. 따라서, 희귀 codons (잠재 일시 사이트)에 풍부 mRNA의 지역은 원칙적으로 messa에 ribosome 움직임이 느려지며각각의 크기는 5-8의 초기 펩티드의 GE와 명분 축적. 이러한 일시 사이트가 단백질 발현에 대한 기능적 영향을 미칠 수 mRNA 안정성 및 검토를위한 단백질 폴딩 9를 참조하십시오. 실제로, 그것은 같은 일시 중지 사이트의 완화는 mRNA에 ribosome 운동을 변경할 수 있으며, 이후 공동 translational (생체내)을 단백질 폴딩 1,7,10,11의 효율성에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 궁극적으로 그것이 translational 연신율 동안 mRNA를 따라 리보솜의 움직임에 대한 코돈 사용 / tRNA 콘텐츠의 영향으로 종합적인 통찰력을 얻기 위해 필수적인 단백질 합성의 과정에 결합되어 세포에서 생체내의 단백질 접힘의 과정을 이해하려면 .
여기에서 우리는 다양한 세포없는 시스템을 6-8로 번역 주어진 mRNA에 대한 주요 번역 일시 사이트를 찾는 데 사용할 수있는 간단한 기술을 설명합니다. 이 절차는 초기 polypeptides accumulati의 고립을 기반으로합니다대상 mRNA의 체외 번역의 도중 리보솜에 NG. 근거는 낮은 주파수 codons에서 해당 규모의 초기 펩티드의 증가 금액 리보솜 결과의 체류 시간 증가. 체외 베꼈는데 mRNA에서 radioactively 라벨이 아미노산의 존재에 체외에서 translational 반응에 사용되고있다는 것입니다 초기 체인의 검출을 허용합니다. ribosome 바운드 초기 폴리펩티드 단지를 분리하기 위해서는 번역 반응은 원심 분리에 의해 다음에 30 % 글리세롤 용액 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있다. polysomal 펠렛의 초기 polypeptides은 더욱 ribonuclease로 치료와 SDS 페이지에 의해 해결된다. 이 기술은 잠재적으로 어떤 단백질에 사용되며 ribosome mRNA를 따라 움직임과 주요 일시 중지 사이트의 검출 분석을 허용 할 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 ribosome 운동을 변경할 수 있으며 따라서 잠재적으로 또 일을 변경할 수있는 요인과 조건을 연구하는 데 적용할 수 있습니다전자 기능 / 단백질의 형태.
프로토콜
1. DNA를 템플릿 준비 및 시험 관내 스크립트 작성에
- 관심있는 유전자는 T7 및 / 또는 예 SP6 transcriptional 발기인 아래에 복제됩니다.
- 시험 관내 전사의 내용은 템플릿 DNA가 ORF 정류장 코돈 및 / 또는 mRNA 3 '끝에 스트림 절삭 적절한 제한 효소로 선형있다. 하나는 아가로 오스 겔 전기 영동에 제한 소화 제품을 실행하여 플라스미드 DNA의 완전한 선형화를 확인해야합니다.
- 선형 플라스미드는 시험 관내 전사 반응에 사용됩니다. 템플릿 DNA의 서로 다른 농도는 시험 관내 전사에 필요한 최적의 DNA 농도를 확인하는 테스트를 할 수 있습니다. 일반적으로 Ambion의 MEGAscript 높은 항복 전사 키트 (Ambion / 생활 기술, 그랜드 아일랜드, NY)로, 1 μg 선형 DNA는 mRNA의 40-60 μg를 얻을. 시험 관내 전사에는 제조 업체의 지침 (Ambion / 생활 기술, 그랜드 Islan에 따라 이루어집니다D, NY).
- 시험 관내 전사에 따라 mRNA는 제조 업체의 지침 (Ambion의 MEGAscript 높은 항복 전사 키트)에 따라....
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토론
시험 관내 전사 및 번역 반응에 사용되는 부품의 재현성 결과, 품질과 집중이 중요하십시오. 현재의 연구에서 우리는 주의깊게 처리하는 경우, 높은 재현성 데이터를 제공 상용 키트와 추출물을 사용했다. 필요한 경우에는 번역 - 관할 추출물은 하나의 선택의 세포에서 작성하실 수 있습니다. mRNA의 품질이 번역에 영향을 미칠 수 있으므로, 그것은 시험 관내 번역하는 동안 그것을 사용하기 전에 mRNAs의 무결성을 테스트하기 위해 가장 중요합니다.
또한, 체외 변환 반응의 기간은 각각의 단백질을 위해 최적화되어야한다. 이것은 초기 polypeptides의 절연을위한 중요한 단계입니다. 연장 보육은 전체 길이 단백질의 합성과 리보솜에서 초기 polypeptides의 대다수의 출시로 연결. 배양 시간이 체외 번역 수행하여 최적화할 수 R다른 시간 포인트 eactions. 장편 단백질의 번역을 위해 필요한 최.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램 보조금 RGP0024에 의해 재정 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 / 키트의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| MEGAscript T7 높은 항복 전사 키트 | Ambion | AM1333 | |
| Ribonuclease 억제제 | Invitrogen | 15518012 | |
| 트랜스 [35 S]-라벨 | MP의 Biomedicals | 0,151,006 | |
| Ribonuclease - | Invitrogen | 12,091 | |
| 래빗 Reticulocyte Lysate 시스템, Nuclease는 치료 | Promega | L4960 | |
| 선형 템플릿에 대한 E. 대장균 S30 추출 시스템 | Promega | L1030 | |
| 원심 분리 | Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 | Optima TLX의 Ultracentrifuge | |
| 저장 형광체 autoradiographY | GE 헬스케어 | 태풍 9,410 가변 모드 영상기 | |
| 초기 폴리펩티드 분석을위한 소프트웨어 | GE 헬스케어 | 이미지 양의 TL, v2005 |
참고문헌
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C.
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재인쇄 및 허가
