Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em> 체외에서</em> mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면
Summary
mRNA의 translational 일시 사이트를 식별하는 기술은 설명되어 있습니다. 이 절차는 denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 초기 체인의 크기를 분석하여 다음 타겟 mRNA의 체외 번역의 도중에 변이를 축적 초기 polypeptides의 분리에 근거한다.
Abstract
translational 신장의 속도가 아닌 교복이다. 이차 구조, 코돈 사용을 mRNA와 1 참조 관련 단백질 검토를 위해 메시지에 ribosome 운동을 변경할 수도 있습니다 mRNA. 그러나 이제는 널리 동의어 코돈 사용하는 비 균일한 translational 신장 속도 1 차 원인임을 인정있어. 동의어 codons는 동일한 주파수로 사용되지 않습니다. 바이어스가 다른이보다 더 자주 사용하는 일부 codons와 동의어 codons의 사용에 있습니다. 코돈 바이어스는 유기체뿐만 아니라 2,3 구체적인 조직이다. 또한 코돈 사용 빈도가 기원 tRNAs 4의 농도에 직접 비례합니다. 따라서 자주 사용하는 코돈은 더 자주 코돈이 빠르게 드문보다 번역된다는 것을 의미합니다 해당 tRNAs 높은 무리를 가질 것입니다. 따라서, 희귀 codons (잠재 일시 사이트)에 풍부 mRNA의 지역은 원칙적으로 messa에 ribosome 움직임이 느려지며각각의 크기는 5-8의 초기 펩티드의 GE와 명분 축적. 이러한 일시 사이트가 단백질 발현에 대한 기능적 영향을 미칠 수 mRNA 안정성 및 검토를위한 단백질 폴딩 9를 참조하십시오. 실제로, 그것은 같은 일시 중지 사이트의 완화는 mRNA에 ribosome 운동을 변경할 수 있으며, 이후 공동 translational (생체내)을 단백질 폴딩 1,7,10,11의 효율성에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 궁극적으로 그것이 translational 연신율 동안 mRNA를 따라 리보솜의 움직임에 대한 코돈 사용 / tRNA 콘텐츠의 영향으로 종합적인 통찰력을 얻기 위해 필수적인 단백질 합성의 과정에 결합되어 세포에서 생체내의 단백질 접힘의 과정을 이해하려면 .
여기에서 우리는 다양한 세포없는 시스템을 6-8로 번역 주어진 mRNA에 대한 주요 번역 일시 사이트를 찾는 데 사용할 수있는 간단한 기술을 설명합니다. 이 절차는 초기 polypeptides accumulati의 고립을 기반으로합니다대상 mRNA의 체외 번역의 도중 리보솜에 NG. 근거는 낮은 주파수 codons에서 해당 규모의 초기 펩티드의 증가 금액 리보솜 결과의 체류 시간 증가. 체외 베꼈는데 mRNA에서 radioactively 라벨이 아미노산의 존재에 체외에서 translational 반응에 사용되고있다는 것입니다 초기 체인의 검출을 허용합니다. ribosome 바운드 초기 폴리펩티드 단지를 분리하기 위해서는 번역 반응은 원심 분리에 의해 다음에 30 % 글리세롤 용액 위에 뛰어넘는 세월을 거슬러 올라가있다. polysomal 펠렛의 초기 polypeptides은 더욱 ribonuclease로 치료와 SDS 페이지에 의해 해결된다. 이 기술은 잠재적으로 어떤 단백질에 사용되며 ribosome mRNA를 따라 움직임과 주요 일시 중지 사이트의 검출 분석을 허용 할 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 ribosome 운동을 변경할 수 있으며 따라서 잠재적으로 또 일을 변경할 수있는 요인과 조건을 연구하는 데 적용할 수 있습니다전자 기능 / 단백질의 형태.
Protocol
Discussion
시험 관내 전사 및 번역 반응에 사용되는 부품의 재현성 결과, 품질과 집중이 중요하십시오. 현재의 연구에서 우리는 주의깊게 처리하는 경우, 높은 재현성 데이터를 제공 상용 키트와 추출물을 사용했다. 필요한 경우에는 번역 – 관할 추출물은 하나의 선택의 세포에서 작성하실 수 있습니다. mRNA의 품질이 번역에 영향을 미칠 수 있으므로, 그것은 시험 관내 번역하는 동안 그?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램 보조금 RGP0024에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
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