Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em> In vitro</em> For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA
Summary
En teknikk for å identifisere translasjonelle pause områder på mRNA blir beskrevet. Denne prosedyren er basert på isolasjon av begynnende polypeptider samler på ribosomer under in vitro oversettelse av et mål mRNA, etterfulgt av størrelsen analyse av de begynnende kjedene bruker en denaturering gel elektroforese.
Abstract
Satsen for translatorisk tøyelighet er ikke-uniform. mRNA sekundær struktur, kodon bruk og mRNA tilhørende proteiner kan endre ribosomet bevegelse på meldingen om overprøving se en. Men det er nå allment akseptert at synonymt kodon bruk er den primære årsaken til ikke-uniforme translasjonelle forlengelse priser 1. Synonyme kodon ikke brukes med identisk frekvens. En skjevhet finnes i bruk av synonyme kodon med noen kodon brukes oftere enn andre 2. Kodon skjevhet er organismen samt vev bestemt 2,3. Dessuten er frekvensen av kodon bruk direkte proporsjonal med konsentrasjonen av cognate tRNAs 4. Dermed vil en ofte brukt kodon har høyere mengde tilsvarende tRNAs, noe som ytterligere innebærer at en hyppig kodon vil bli oversatt raskere enn en sjelden en. Dermed vil områder på mRNA anriket i sjeldne kodon (potensiell pause nettsteder) som regel tregere ribosomet bevegelse på Message og årsak akkumulering av begynnende peptider av de respektive størrelser 5-8. Disse pause nettstedene kan ha funksjonell innvirkning på protein uttrykk, mRNA stabilitet og protein folding for vurdering se ni. Faktisk ble det vist at lindring av slike pause nettstedene kan endre ribosomet bevegelse på mRNA og deretter kan påvirke effektiviteten av co-translatorisk (in vivo) proteinfolding 1,7,10,11. For å forstå prosessen med protein folding in vivo, i cellen, som er slutt koblet til prosessen med protein syntese er det viktig å få omfattende innsikt i effekten av kodon bruk / tRNA innhold på bevegelsen av ribosomer langs mRNA under translasjonsforskning tøyelighet .
Her beskriver vi en enkel teknikk som kan brukes til å lokalisere større oversettelse pause områder for et gitt mRNA oversatt i ulike celle-frie systemer 6-8. Denne prosedyren er basert på isolasjon av begynnende polypeptider accumulating på ribosomer under in vitro oversettelse av et mål mRNA. Begrunnelsen er at lavfrekvente kodon, økningen i oppholdstid av ribosomene resulterer i økte mengder begynnende peptider av tilsvarende størrelse. In vitro transkribert mRNA brukes til in vitro translasjonelle reaksjoner i nærvær av radioaktivt merket aminosyrer å tillate deteksjon av begynnende kjedene. For å isolere ribosomet innbundne begynnende polypeptid komplekser oversettelsen reaksjonen er lagdelt på toppen av 30% glycerol løsning etterfulgt av sentrifugering. Gryende polypeptider i polysomal pellet er videre behandlet med ribonuklease A og løses av SDS PAGE. Denne teknikken kan potensielt brukes til noe protein og tillater analyse av ribosome bevegelse langs mRNA og påvisning av de store pause nettsteder. I tillegg kan denne protokollen tilpasses studere faktorer og forhold som kan endre ribosomet bevegelse og dermed potensielt kan også endre the funksjon / konformasjon av protein.
Protocol
Discussion
For reproduserbare resultater, kvalitet og konsentrasjon av komponentene som brukes for in vitro transkripsjon og oversettelse reaksjoner er kritiske. I denne studien har vi brukt kommersielt tilgjengelige kits og ekstrakter som gir svært reproduserbare data, hvis håndteres forsiktig. Imidlertid kan oversettelse-kompetente ekstrakter være forberedt fra cellen av ens valg, om nødvendig. Kvalitet av mRNA kan påvirke oversettelsen, så det er av største betydning for å teste integriteten til mRNA før du br…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Human Frontier Science Program stipend RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A “silent” polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
