Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em> In vitro</em> MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme
Summary
MRNA üzerindeki translasyonel duraklama siteleri tanımlamak için bir teknik tarif edilmiştir. Bu prosedür bir denatüre jel elektroforez ile olgunlaşmamış zincirlerinin boyutu analizi ve ardından bir hedef mRNA in vitro için, içerisinde sırasında ribozom üzerinde biriken olgunlaşmamış polipeptidlerin izolasyonu dayanmaktadır.
Abstract
Translasyonel uzama oranı non-üniform. ikincil yapı, kodon kullanım mRNA ve 1 görmek ilişkili proteinlerin inceleme için mesaj üzerinde ribozom hareketini değiştirebilir mRNA'ya. Ancak, günümüzde yaygın eşanlamlı kodon kullanımı düzgün olmayan translasyonal uzama oranları 1 birincil nedeni olduğu kabul edilmektedir. Eşanlamlıdır kodonlar aynı frekansı ile kullanılmaz. Bir önyargı diğerleri 2 daha sık kullanılan bazı kodonlar ile eşanlamlı kodon kullanımı var. Kodon önyargı organizma gibi 2,3 spesifik bir dokudur. Dahası, kodon kullanımına sıklığı soydaş tRNAs 4 konsantrasyonları ile doğrudan orantılıdır. Böylece, sık kullanılan bir kodon daha sık bir kodon hızlı bir seyrek bir daha tercüme edilecektir ima ilgili tRNAs yüksek sayıda sahip olacak. Böylece, nadir kodonlar (potansiyel duraklama siteleri) zenginleştirilmiş mRNA üzerindeki bölgelerde kural olarak Messa üzerinde ribozom hareketi yavaşlatacakilgili boyutları 5-8 doğmakta peptidlerin ge ve neden birikimi. Bu duraklama siteler protein ekspresyonu fonksiyonel etkisi olabilir, mRNA stabilitesi ve inceleme için protein katlanması 9'a bakın. Gerçekten de, bu tür duraklama siteleri hafifletilmesi mRNA üzerinde ribozom hareketi değiştirebilir ve daha sonra co-translasyon (in vivo) protein katlama 1,7,10,11 etkinliğini etkileyebilir olduğu gösterilmiştir. Sonuçta o translasyonel uzama sırasında mRNA boyunca ribozomların hareketine kodon kullanım / tRNA içerik etkisi içine kapsamlı bilgiler edinmek için gerekli olan protein sentezinin sürecine birleşen hücre, in vivo protein katlanması süreci anlamak için .
Burada çeşitli hücre içermeyen sistemlerde 6-8 tercüme belirli bir mRNA için büyük çevirisi duraklama yerleri bulmak için kullanılabilecek basit bir teknik açıklar. Bu prosedür, olgunlaşmamış polipeptidlerin accumulati izolasyonu dayanmaktadırbir hedef mRNA in vitro çeviri sırasında ribozomlar üzerinde ng. Mantığı düşük frekanslı kodonlar az, karşılık gelen boyutlarda olgunlaşmamış peptid artan miktarlarda ribozom sonuçların kalma süresi de artar. In vitro transkripsiyonu mRNA olarak radyoaktif olarak etiketlenmiş amino asitlerin varlığında in vitro translasyon reaksiyonlar için kullanılan olmasıdır doğmakta olan zincirlerinin algılanmasına izin vermek için. Ribozom bağlı olgunlaşmamış bir polipeptid kompleksleri izole etmek için, reaksiyon için santrifüjleme ardından% 30 gliserol çözeltisi üstüne katmanlı edilir. Polysomal pelet yılında Doğan polipeptidlerin daha ribonükleaz A ile tedavi edilen ve SDS PAGE ile çözümlenir. Bu teknik potansiyel olarak herhangi bir protein için kullanılan ve ribozom mRNA boyunca hareket ve büyük duraklama sitelerin tespiti analizi sağlar edilebilir. Ayrıca, bu protokol ribozom hareketi değiştirebilir ve böylece potansiyel olarak da inci değiştirebilir faktörleri ve koşulları incelemek için adapte edilebilire fonksiyon / proteinin konformasyon.
Protocol
Discussion
In vitro transkripsiyonu ve translasyon reaksiyonlarda kullanılan bileşenlerin tekrarlanabilir sonuçlar, kalite ve konsantrasyonu için kritiktir. Mevcut çalışmada dikkatli kullanılırsa, yüksek oranda tekrarlanabilir veri sağlamak ticari kitler ve özleri kullanmışlardır. Gerekirse Bununla birlikte, çeviri-yetkin özler, birinin tercih edilen hücre ile hazırlanabilir. MRNA Kalite çeviri etkileyebilir, bu nedenle in vitro çeviri sırasında kullanmadan önce mRNA'ların b?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma İnsan Frontier Bilim Programı hibe RGP0024 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Ribonuclease-A | Invitrogen | 12091 |
| Rabbit Reticulocyte Lysate System, Nuclease Treated | Promega | L4960 |
| E. coli S30 Extract System for Linear Templates | Promega | L1030 |
| Centrifugation | Beckman Coulter | Optima TLX Ultracentrifuge |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Software for nascent polypeptide analysis | GE Healthcare | Image Quant TL, v2005 |
References
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity. Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2, e221 (2006).
- Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).
- Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model. J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).
- Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).
- Komar, A. A., Jaenicke, R. Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding. FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).
- Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).
- Thanaraj, T. A., Argos, P. Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).
- Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. A “silent” polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses. J. Vis. Exp. (48), e2498 (2011).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324, 218-223 (2009).
