המתואר כאן טכניקה כיום בשימוש שגרתי לבודד קשורות ביציבות הריבוזום מתחמי הרשת המתהווה (RNCs). שיטה זו מנצלת את הגילוי כי 17 חומצות אמינו ארוכה SecM "מעצר רצף" יכול לעצור את התארכות תרגום פרוקריוטים (<em> א ' coli</em>) המערכת, כאשר מוכנס לתוך (או התמזגו למסוף-C) של חלבון כמעט בכל.
מחקר מקיף סיפקה ראיות בשפע טוען כי קיפול חלבונים בתא הוא תהליך שיתוף translational 1-5. עם זאת, המסלול המדויק שרשרת פוליפפטיד כדלקמן במהלך קיפול שיתוף translational להשיג טופס הפונקציונלי הוא עדיין חידה. על מנת להבין את התהליך הזה כדי לקבוע את הקונפורמציה המדויק של שיתוף ביניים של תרגום מתקפלים, חשוב לפתח שיטות המאפשרות בידוד של RNCs שנשאו רשתות המתהווה בגדלים קבועים מראש על מנת לאפשר ניתוח מבנית נוספת שלהם.
SecM (צג הפרשת) הוא 170 חומצות אמינו א ' coli חלבון המווסת את ביטוי של ATPase במורד הזרם (נהיגה הפרשת) SecA ב operon secM-secA 6. Nakatogawa ו איטו במקור נמצא כי רצף 17 חומצות אמינו ארוכה (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) באזור C-terminal של החלבון SecM מספיק וצריךכי השתהות של התארכות SecM ב Gly165, ובכך לייצר peptidyl-glycyl-tRNA קשורה ביציבות אל ריבוזומלי P-האתר 7-9. יתרה מכך, נמצא כי 17 זה רצף חומצות האמינו זמן רב ניתן קיבע את הסופית-C של חלבון כמעט בכל באורך מלא ו / או מקוצר ובכך מאפשר ייצור של RNCs שנשאו רשתות המתהווה בגדלים קבועים מראש 7. לכן, כאשר התמזגו או מוכנס לתוך היעד החלבון, רצף SecM מייצר השתהות מעצרו של התארכות שרשרת פוליפפטיד ומייצר RNCs יציבים הן in vivo של א ' קולי תאים במבחנה במערכת התא ללא. שיפוע צנטריפוגה סוכרוז הוא מנוצל יותר לבודד RNCs.
RNCs את בודדים ניתן לנתח מאפיינים מבניים ותפקודיים של שיתוף ביניים של תרגום מתקפלים. לאחרונה, טכניקה זו שימשה בהצלחה להבנה טובה של המבנה של הריבוזום שרשראות כמה המתהווה קשורות 10,11. כאן אנו מתארים את הבידוד של Crystallin שור Gamma-B RNCs התמזגו כדי SecM ו שנוצר במערכת בתרגום חוץ גופית.
לקבלת תוצאות לשחזור, איכות ריכוז המרכיבים המשמשים ב שעתוק במבחנה התרגום הן קריטיות. השתמשנו זמינים מסחרית שעתוק במבחנה תמציות תרגום והם נותנים תוצאות יעיל לשחזור, אם מטופל בזהירות. האיכות של ה-mRNA יכול להשפיע על התרגום, ולכן הוא בעל חשיבות עליונה ל?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי תוכנית מדע האדם Frontier מענק RGP0024.
Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 |
Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 |
Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System |
Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |