Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound
Summary
Descriviamo qui una tecnica che viene ora utilizzato di routine per isolare complessi ribosoma stabilmente legati a catena nascente (RNC). Questa tecnica sfrutta la scoperta che un 17 aminoacidi lungo "sequenza di arresto" SECM può fermare l'allungamento traduzione in un procariota (<em> E. coli</em>) Del sistema, quando inserito (o fusa al C-terminale) di qualsiasi proteina.
Abstract
Numerose ricerche hanno fornito ampie evidenze che suggeriscono che le proteine ripiegare nella cellula è un processo di co-traslazionale 1-5. Tuttavia, il percorso esatto che segue catena polipeptidica durante la co-traslazionale pieghevole per raggiungere la sua forma funzionale è ancora un enigma. Per comprendere questo processo e di determinare l'esatta conformazione degli intermedi pieghevoli co-traslazionale, è necessario sviluppare tecniche che consentono l'isolamento di RNC trasportano nascenti catene di dimensioni predeterminate per consentire loro ulteriori analisi strutturale.
SECM (monitor secrezione) è un aminoacido 170 E. coli proteina che regola l'espressione della valle Seca (guida secrezione) ATPasi nel SECM-seca operone 6. Nakatogawa e Ito originariamente scoperto che una sequenza amminoacidica 17 lungo (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) nella regione C-terminale della proteina SECM è sufficiente e necessariocausare lo stallo di allungamento SECM a Gly165, producendo così peptidil-glicil-tRNA stabilmente legata alla ribosomiale P-site 7-9. Ancora più importante, è stato trovato che questa sequenza amminoacidica 17 lungo può essere fusa al C-terminale di qualsiasi proteina a lunghezza intera e / o troncato permettendo la produzione di RNC trasportano nascenti catene di dimensioni predeterminate 7. Così, quando fuse o inserito nella proteina bersaglio, la sequenza SECM stallo produce arresto del l'allungamento della catena polipeptidica e genera RNC stabili in vivo sia in E. coli e in vitro in un sistema acellulare. Centrifugazione in gradiente di saccarosio è inoltre utilizzata per isolare RNC.
I RNC isolati possono essere utilizzati per analizzare le caratteristiche strutturali e funzionali degli intermedi pieghevoli co-traslazionale. Recentemente, questa tecnica è stata utilizzata con successo per acquisire conoscenze nella struttura di alcune catene di ribosoma legati nascenti 10,11. Qui si descrive l'isolamento di bovino Gamma-B sonoro superiore cristallino RNC fusa SECM e generato in un sistema di traduzione in vitro.
Protocol
Discussion
Per risultati riproducibili, la qualità e la concentrazione dei componenti utilizzati per la trascrizione e traduzione in vitro sono critiche. Abbiamo usato commercialmente disponibile la trascrizione in vitro ed estratti di traduzione e danno risultati efficaci e riproducibili, se maneggiato con cura. Qualità di mRNA può influenzare la traduzione, quindi è della massima importanza per testare l'integrità di mRNA prima di utilizzarlo per traduzione in vitro. Il tempo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal programma Human Frontier Science concessione RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
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