Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider
Summary
Vi beskriver här en teknik som nu används rutinmässigt för att isolera stabilt bunden ribosom framväxande kedjan komplex (RNC). Denna teknik drar fördel av upptäckten att en 17 aminosyror lång SecM "gripande sekvens" kan stoppa översättning töjning i en prokaryot (<em> E. coli</em>)-System, när de sätts in (eller fuserad till C-terminalen) av praktiskt taget vilket protein som helst.
Abstract
Omfattande forskning har gett gott om bevis som tyder på att protein vika i cellen är ett samarbete translationell process 1-5. Men är den exakta väg som polypeptidkedja följer vid samtidig translationell vikning för att uppnå funktionell form fortfarande en gåta. För att förstå denna process och att bestämma den exakta utformningen av de sam-translationella hopfällbara intermediärer, är det viktigt att utveckla tekniker som gör det möjligt isolering av RNC bär begynnande kedjor av förutbestämda storlek att de kan ytterligare strukturella analys.
SecM (utsöndring monitor) är en 170 aminosyror E. coli protein som reglerar uttrycket av nedströms SecA (sekretion körning) ATPas i secM-seca operon 6. Nakatogawa och Ito funnit ursprungligen som en 17 aminosyror lång sekvens (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) i den C-terminala regionen av SecM proteinet kunna räcka för attorsaka blockering av SecM töjning vid Gly165, varigenom peptidyl-glycyl-tRNA stabilt bunden till den ribosomala P-platsen 7-9. Ännu viktigare, fann man att denna 17 aminosyror långa sekvensen kan vara sammansmält med C-terminalen av praktiskt taget vilken full längd och / eller trunkerade proteinet vilket möjliggör framställning av RNC transporterar begynnande kedjor av förutbestämda storlekar 7. Således, när smält eller sättas in i mål-proteinet, producerar SecM tjuvstopp sekvens gripande av polypeptiden kedjeförlängningen och genererar en stabil RNC både in vivo i E. coli-celler och in vitro i ett cellfritt system. Sackarosgradientcentrifugering vidare användas för att isolera RNC.
De isolerade RNC kan användas för att analysera strukturella och funktionella egenskaper hos de samtidigt translationella fällbara intermediärer. Nyligen har denna teknik använts framgångsrikt för att få insikt i strukturen av ett flertal ribosom bundna begynnande kedjor 10,11,. Här beskriver vi isoleringen av bovint gamma-B-kristallin RNC smält till SecM och genereras i en in vitro-translationssystem.
Protocol
Discussion
För reproducerbara resultat, kvalitet och koncentrationen av de komponenter som används för in vitro transkription och translation är kritiska. Vi har använt kommersiellt tillgängliga in vitro transkription och extrakt översättning och de ger effektiva och reproducerbara resultat, om den hanteras varsamt. Kvaliteten på mRNA kan påverka översättningen, så det är av yttersta vikt att testa integritet mRNA innan du använder den för in vitro translation. Inkubationstiden för i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av Human Frontier Science Program bidrag RGP0024.
Materials
| Name of reagent/ Kit | Company | Catalogue number |
| MEGAscript T7 High yield Transcription Kit | Ambion | AM1333 |
| RTS 100 E.coli HY Kit | 5 Prime | 2401100 |
| Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 15518012 |
| Trans [35S]-Label | MP Biomedicals | 0151006 |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC801008 |
| Storage phosphor autoradiography | GE Healthcare | Typhoon 9410 variable mode imager |
| Density Gradient Fractionation Systems | Teledyne Isco, Inc. | ISCO Programmable Density Gradient System |
| Sucrose Gradient Centrifugation | Beckman Coulter | Optima L-90 K Preparative Ultracentrifuge |
References
- Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. Cotranslational protein folding. J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).
- Hardesty, B., Kramer, G. Folding of a nascent peptide on the ribosome. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).
- Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).
- Komar, A. A. A pause for thought along the co-translational folding pathway. Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).
- Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Protein folding on the ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).
- Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon. J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).
- Nakatogawa, H., Ito, K. The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate. Cell. 108, 629-636 (2002).
- Nakatogawa, H., Ito, K. Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol. Mol. Cell. 7, 185-192 .
- Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall. Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).
- Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).
- Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).
- Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289, 905-920 (2000).
- Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel. J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. Cotranslational folding of globin. J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).
- Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science. 271, 990-993 (1996).
- Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro. Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).
