Heterokaryon Oluşumu İki Yöntemleri HCV Sınırlayıcı Etkenler Discover
Summary
Biz, koşullu için iki yöntem tarif<em> Trans</emHepatit C virüsü (HCV) montaj ve heterokaryon oluşumu itimat tam viral yaşam döngüsü, tamamlanması>-tamamlayamamakta. Bu teknikler bulaşıcı HCV döl üretimi engel baskın kısıtlama faktörler, ifade hücre hatları için ekran uygundur.
Abstract
Hepatit C virüsü (HCV), insan ve şempanze sınırlı bir ana-aralığı ile hepatotropic virüstür. HCV RNA çoğaltma insan olmayan karaciğer ve fare hücre hatlarında gözlenmiştir rağmen, verimliliği çok düşük olduğunu ve HCV replikon kullanarak gerekli uzun vadeli seçim prosedürleri baskın antibiyotik seçilebilir işaretleri 1-5 ifade oluşturur. In vitro araştırma HCV nedenle virüs ömrü çevrimi ile virüs girişi ve tamamlanması için ılımlı insan hepatoma hücre çizgileri ile sınırlıdır. Dar türler tropizm HKH'lerinin nedeniyle, tam HCV replikasyon siklusu 6-8 ayakta kullanılabilen bir bağışıklık küçük bir hayvan modeli yoktur. Fare kökenli örneğin insan olmayan hücrelerin HCV verimsiz çoğaltma olasılıkla önemli konak bağımlılık faktörleri ve / veya kısıtlama faktörlerin ifade genetik uyumsuzluk eksikliğinden kaynaklanmaktadır.
Biz HCV yayılım baskın kısıtlama fa tarafından bastırılmış olup olmadığını araştırmaknon-hepatik dokulardan veya fare karaciğer hücre hatlarında edilen insan hücre dizileri ya da ctors. Bu amaçla, somatik hücre füzyonu dayanarak iki bağımsız koşullu trans-tümleme yöntemleri geliştirdi. Her iki durumda da, viral döngüsü tamamlanmasından heterokaryonlar de mümkündür. Sonuç olarak, bulaşıcı döl viral de novo üretiminin ölçülmesi ile tespit edilir başarılı bir trans-tümleme, baskın bir kısıtlama olmadığı gösterir.
Spesifik olarak, bir lusiferaz transgeni taşıyan alt genomik HCV Replikon çok ılımlı insan hepatoma hücreleri (Ha-7,5 hücreleri) içine transfekte edildi. Daha sonra, bu hücreler kültürlendi ve co-HCV yapısal proteinler çekirdek, zarfı 1 ve 2 (E1 ve E2) ve yardımcı proteinler p7 ve NS2 eksprese eden çeşitli insan ve fare hücrelere kaynaşmıştır. Hücre füzyon polietilen-glikol (PEG) ile muamele ile başlatılmıştır koşuluyla, kültür bulaşıcı virüs pa serbestbir reseptör bağımlı bir tarzda naif hücreleri enfekte rticles.
Hücreye girişi, RNA çeviri, çoğaltma ve virüs montaj dahil tam viral yaşam döngüsü baskın kısıtlamaların etkisini değerlendirmek için, biz, CD81 endojen ifade yoksun bir insan karaciğer hücre dizisi (Huh-7 Lunet N hücreler 9) yararlandı HCV temel bir giriş faktörü. Ektopik ifade edilen CD81 yokluğunda, bu hücrelerin HCV enfeksiyonu 10 esasen refrakter vardır. Daha da önemlisi, ortak kültüre ve insan CD81 ancak eksikliği en azından önemli bir başka hücreye girişi faktörü (örneğin SR-BI, CLDN1, OCLN) ifade hücreleri ile kaynaşmış, yalnızca ortaya çıkan heterokaryonlar enfeksiyonu için gerekli HCV giriş faktörlerin komple set gösterilecek. Bu nedenle, egemen kısıtlama faktörler HCV çoğaltma döngüsü tamamlanmasından bastırmak olmadığını analiz etmek, biz yukarıda belirtilen crit yerine fare ve insan kaynaklı çeşitli hücreleri Lunet N hücreleri eritilireria. Co-kültürlenmiş hücrelerde prototipi köpüksü virüs mutantı yüksek bir füzojenik Viral zarfın protein (PFV 11) ile transfekte edilmiş ve daha sonra bulaşıcı parçacıklar HCV (HCVcc) ile karşılaştırılan edildiğinde, bulaşıcı virüsün üretimini de novo gözlenmiştir. Bu HCV başarıyla böylece bu hücre hatları hakim kısıtlama faktörlerin ifadesi ortadan heterokaryonlar kendi çoğaltma döngüsü tamamlanmış olduğunu gösterir. Bu yeni şartlı trans-tümleme yöntemleri HCV-özgü baskın kısıtlama faktörlerin ifadesi için hücre hatları ve birincil hücreler büyük bir paneli taramak için yararlı olacaktır.
Protocol
Discussion
Biz HCV çoğaltma engel dominant negatif kısıtlamaların analizi için kültür hücreleri heterokaryon oluşumunu uyarmak için iki yöntem sunuyoruz. Bu prosedürler kullanılarak çeşitli insan olmayan karaciğer ve murin karaciğer hücre çizgileri baskın bir yapısal olarak ifade edilen veya virüs kaynaklı faktörü varlığında bırakıldı. Kısıtlama faktörler bulaşıcı döl HCV montaj ve salınımını önlemek eğer ilk testi öncelikle analiz eder. Bu durumda ambalaj hücreleri HCV replikon hücr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Takaji Wakita sırasıyla JFH1 ve J6CF izolatlar için Jens Bukh, minnettarız. Ayrıca biz Charles Huh-7.5 hücreler için Rice ve 9E10 antikor, E2-spesifik antikor CBH-23 Steven Foung ve Deneysel Viroloji, faydalı öneri ve tartışmalar için Twincore Bölümü tüm üyelerine teşekkür ediyorum.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | |
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | |
| DAPI (4′,6′- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 |
| Alexa-Fluor 546 – goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 |
| Alexa-Fluor 488 – goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | |
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
References
- Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).
- Kato, T. Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon. J. Virol. 79, 592-596 (2005).
- Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line. J. Virol. 78, 491-501 (2004).
- Date, T. Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells. J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).
- Chang, K. S. Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities. J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).
- Zhong, J. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).
- Lindenbach, B. D. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309, 623-626 (2005).
- Wakita, T. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat. Med. 11, 791-796 (2005).
- Witteveldt, J. CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells. J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).
- Bitzegeio, J. Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).
- Lindemann, D., Goepfert, P. A. The foamy virus envelope glycoproteins. Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).
- Brohm, C. Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation. J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).
- Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles. J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).
- Koutsoudakis, G. Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses. J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).
- Frentzen, A. Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines. PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).
- Lindemann, D. A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity. J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).
- Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).
