Produksjon av Lentiviral vektorer for Transducing Celler fra Central Nervous System
Summary
I denne protokollen beskriver vi produksjon, rensing og titrering av lentiviral vektorer. Vi tilbyr et eksempel på lentiviral vektor-mediert genet levering i primære dyrkede nerveceller og astrocytes. Våre metoder kan også gjelde for andre celletyper<em> In vitro</em> Og<em> In vivo</em>.
Abstract
Effektiv genet levering i sentralnervesystemet (CNS) er viktig i å studere gen-funksjoner, modellering nevrologiske sykdommer og utvikle terapeutiske tilnærminger. Lentiviral vektorer er attraktive verktøy i transduksjon av nerveceller og andre celletyper i CNS som de transduce både skillelinjer og ikke-delende celler, støtte vedvarende uttrykk for transgener, og har relativt stor emballasje kapasitet og lav toksisitet 1-3. Lentiviral vektorer har blitt brukt i transducing mange nevrale celletyper in vitro 4-6 og i dyr 7-10.
Stor innsats er gjort for å utvikle lentiviral vektorer med forbedret biosikkerhet og effektivitet for genet levering. De nåværende tredje generasjons replikering-defekte og selv-inaktivere (SIN) lentiviral vektorer er avbildet i figur 1. De nødvendige elementene for vektor emballasje er delt inn i fire plasmider. I lentiviral transfer plasmid er U3-regionen i 5 'lange terminal gjenta (LTR) erstattet med en sterk promoter fra et annet virus. Denne endringen gjør at transkripsjon av vektoren sekvensen uavhengig av HIV-1 Tat protein som normalt kreves for HIV genuttrykk 11. Emballasjen signal (Ψ) er avgjørende for encapsidation og Rev-responsive element (Børre) kreves for å produsere høy titer vektorer. Den sentrale polypurine tarmkanalen (cPPT) er viktig for kjernefysisk import av vektor-DNA, en funksjon som kreves for transducing ikke-delende celler 12. I 3 'LTR, er cis-regulatoriske sekvenser fullstendig fjernet fra U3 regionen. Denne slettingen er kopiert til 5 'LTR etter revers transkripsjon, som resulterer i transcriptional inaktivering av begge liter. Plasmidet pMDLg / pRRE inneholder HIV-1 gag / pol gener som gir strukturelle proteiner og revers transkriptase. pRSV-Rev koder Rev som binder seg til Børre for effektiv RNA eksport fra kjernen. pCMV-G kodervesicula stomatitt viruset glykoprotein (VSV-G) som erstatter HIV-1 konv. VSV-G utvider tropisme av vektorene og gir konsentrasjon via ultracentrifugation 13. Alle gener som koder de ekstra proteiner, deriblant Vif, VPR, VPU, og Nef er utelukket i emballasjen systemet. Produksjonen og manipulering av lentiviral vektorer skal utføres i henhold til NIH retningslinjer for forskning som involverer rekombinant DNA ( http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf ). En godkjenning fra individ Institusjonell biologiske og kjemiske Safety Committee kan være nødvendig før bruk lentiviral vektorer. Lentiviral vektorer er ofte produsert av cotransfection av 293T celler med lentiviral overføring plasmid og hjelperåndene plasmider som koder for proteiner som kreves for vektor emballasje. Mange lentiviral overføre plasmider og hjelpeprogrammer plasmider kan fås fra Addgene, en non-Profit plasmidet repository ( http://www.addgene.org/~~V ). Noen stabile emballasje cellelinjer har blitt utviklet, men disse systemene gir mindre fleksibilitet og emballasje effektivitet generelt avtar over tid 14, 15. Kommersielt tilgjengelige transfeksjon kits kan støtte høy effektivitet av transfeksjon 16, men de kan være svært dyrt for storskala vektor forberedelser. Kalsium fosfat nedbør metoder gir svært effektiv transfeksjon av 293T celler og dermed gi et pålitelig og kostnadseffektiv tilnærming for lentiviral vektor produksjon.
I denne protokollen, produserer vi lentiviral vektorer ved cotransfection av 293T celler med fire plasmider basert på kalsiumfosfat nedbør prinsipp, etterfulgt av rensing og konsentrasjon med ultracentrifugation gjennom en 20% sukrose pute. De vektor titere bestemmes av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analysis eller ved sanntid qPCR. Produksjonen og titrering av lentiviral vektorer i denne protokollen kan være ferdig med 9 dager. Vi tilbyr et eksempel på transducing disse vektorer i murine neokortikale kulturer som inneholder både nerveceller og astrocytes. Vi viser at lentiviral vektorer støtte høy effektivitet transduksjon og celle type-spesifikk genekspresjon i primære dyrkede celler fra CNS.
Protocol
Discussion
I denne protokollen, har vi vist produksjonen av lentiviral vektorer og anvendelse av disse vektorer i neokortikale kulturer. Vi viste effektiv og celletype-spesifikk transduksjon med vektorer produsert av disse metodene. Når synapsin promoter brukes, er GFP uttrykk strengt neuron spesifikk. Når GFAP promoter brukes, er GFP uttrykk utelukkende i astrocytes. Hvis ingen celletype-spesifikke uttrykk er nødvendig, kan en allestedsnærværende promoter brukes. Vi fant både ubiqutin og phosphoglycerate kinase (PGK) arrang…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH Neuroscience Blueprint Core-stipend (P30 NS057105, BJS) til Washington University, Program Project Grant NS032636 (BJS) og av håp Center for nevrologiske lidelser.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SV3001403 |
| PBS | Mediatech | 21-040-CM |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 |
| HT1080 cells | ATCC | CCL-121 |
| Falcon 100 x 20 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 |
| 1 x 3 ½ in polyallomoer centrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 |
| 0.2-micron syringe filter | Corning | 431219 |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
References
- Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 72, 9873-9880 (1998).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 4, 353-364 (2003).
- Gascon, S., Paez-Gomez, J. A., Diaz-Guerra, M., Scheiffele, P., Scholl, F. G. Dual-promoter lentiviral vectors for constitutive and regulated gene expression in neurons. J. Neurosci. Methods. 168, 104-1012 (2008).
- Hioki, H. Efficient gene transduction of neurons by lentivirus with enhanced neuron-specific promoters. Gene Ther. 14, 872-882 (2007).
- Li, M. Optimal promoter usage for lentiviral vector-mediated transduction of cultured central nervous system cells. J. Neurosci. Methods. 189, 56-64 (2010).
- Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., Verma, I. M. Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11382-11388 (1996).
- Blomer, U. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J. Virol. 71, 6641-6649 (1997).
- Consiglio, A. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14835-14840 (2004).
- Jakobsson, J., Ericson, C., Jansson, M., Bjork, E., Lundberg, C. Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J. Neurosci. Res. 73, 876-885 (2003).
- Arya, S. K., Guo, C., Josephs, S. F., Wong-Staal, F. Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III). Science. 229, 69-73 (1985).
- Sirven, A. The human immunodeficiency virus type-1 central DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of human hematopoietic stem cells. Blood. 96, 4103-4110 (2000).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8033-8037 (1993).
- Farson, D. A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 981-997 (2001).
- Broussau, S. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Mol. Ther. 16, 500-507 (2008).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J. Vis. Exp. (32), e1499 (2009).
- Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Ther. 9, 1155-1162 (2002).
- Snider, B. J., Lobner, D., Yamada, K. A., Choi, D. W. Conditioning heat stress reduces excitotoxic and apoptotic components of oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death in vitro. J. Neurochem. 70, 120-129 (1998).
- Mazarakis, N. D. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum. Mol. Genet. 10, 2109-2121 (2001).
- Kato, S. Neuron-specific gene transfer through retrograde transport of lentiviral vector pseudotyped with a novel type of fusion envelope glycoprotein. Hum. Gene Ther. 22, 1511-1523 (2011).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Kutner, R. H., Puthli, S., Marino, M. P., Reiser, J. Simplified production and concentration of HIV-1-based lentiviral vectors using HYPERFlask vessels and anion exchange membrane chromatography. BMC Biotechnol. 9, 10 (2009).
- Laughlin, M. A., Chang, G. Y., Oakes, J. W., Gonzalez-Scarano, F., Pomerantz, R. J. Sodium butyrate stimulation of HIV-1 gene expression: a novel mechanism of induction independent of NF-kappa B. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 9, 332-339 (1995).
- Gasmi, M. Requirements for efficient production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J. Virol. 73, 1828-1834 (1999).
- Palsson, B., Andreadis, S. The physico-chemical factors that govern retrovirus-mediated gene transfer. Exp. Hematol. 25, 94-102 (1997).
- Lizee, G. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression. Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).
- Lee, J. K., Chung, J., McAlpine, F. E., Tansey, M. G. Regulator of G-Protein Signaling-10 Negatively Regulates NF-{kappa}B in Microglia and Neuroprotects Dopaminergic Neurons in Hemiparkinsonian Rats. J. Neurosci. 31, 11879-11888 (2011).
- Shevtsova, Z., Malik, J. M., Michel, U., Bahr, M., Kugler, S. Promoters and serotypes: targeting of adeno-associated virus vectors for gene transfer in the rat central nervous system in vitro and in vivo. Exp. Physiol. 90, 53-59 (2005).
