Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo
Summary
Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.
Abstract
Los neutrófilos son el tipo más abundante de glóbulo blanco. Ellos forman una parte esencial del sistema inmune innato 1. Durante la inflamación aguda, los neutrófilos son las primeras células inflamatorias para migrar a la zona de la lesión. El reclutamiento de los neutrófilos a un sitio de la lesión es un proceso gradual que incluye la dilatación en primer lugar, de los vasos sanguíneos para aumentar el flujo de sangre, en segundo lugar, los cambios estructurales microvasculares y escapar de las proteínas plasmáticas de la sangre, la adhesión en tercer lugar, de rodadura, y la transmigración de los neutrófilos a través de la endotelio; y cuarto acumulación de neutrófilos en el sitio de la lesión 2,3. Una amplia gama de in vivo e in vitro se ha desarrollado métodos para permitir el estudio de estos procesos 4. Este método se centra en la transmigración de neutrófilos a través de las células endoteliales humanas.
Un método popular para el examen de los procesos moleculares implicados en la transmigración de neutrófilos humanos utiliza neutrophils que interactúan con las células humanas primarias endoteliales de vena umbilical (HUVEC) 5. Aislamiento de los neutrófilos se ha descrito en otros lugares visual 6, por lo que este artículo le mostrará el método de aislamiento de HUVEC. Una vez aisladas y cultivadas hasta confluencia, las células endoteliales se activan resultante en la regulación positiva de moléculas de adhesión y la activación. Por ejemplo, la activación de las células endoteliales con citocinas como el TNF-alfa resulta en aumento de E-selectina e IL-8 expresión 7. E-selectina media de captura y la rodadura de los neutrófilos y la IL-8 y media la activación firme adhesión de los neutrófilos. Después de los neutrófilos de adhesión transmigrar. Transmigración puede ocurrir paracellularly (a través de uniones de las células endoteliales) o transcellularly (a través de la célula endotelial sí mismo). En la mayoría de los casos, estas interacciones se producen bajo condiciones de flujo que se encuentran en la vasculatura 7,8.
La cámara de la placa de flujo paralelo es un sistema ampliamente utilizado que mimicrófonos el cizallamiento hidrodinámico tensiones encontrado in vivo y permite el estudio de reclutamiento de neutrófilos bajo condición de flujo in vitro de 9,10. Varias empresas producir paralelas cámaras de flujo de placa y cada uno tiene ventajas y desventajas. Si fluorescente de imágenes que se necesita, vidrio o un polímero ópticamente similares necesita ser utilizado. Las células endoteliales no crecen bien en el vidrio.
Aquí presentamos un método fácil y rápida para obtener imágenes de contraste de fases, DIC y fluorescencia de la transmigración de neutrófilos con un bajo volumen de diapositivas canal ibidi hecha de un polímero que se apoya la adhesión rápida y el crecimiento de las células endoteliales humanas y tiene propiedades ópticas que son comparables a vidrio. En este método, las células endoteliales se cultivaron y estimulada en una μslide ibidi. Los neutrófilos se presentó bajo condiciones de flujo y la migración se evaluó. Imagen fluorescente de las uniones activado en tiempo real determinación de la extensión de paracelular frentetranscelular la transmigración.
Protocol
Discussion
Los investigadores han utilizado rutinariamente las células endoteliales de los diferentes lechos vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos y la transmigración. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, células endoteliales microvasculares dérmicas 12, el hígado células endoteliales sinusoidales 13 y las células endoteliales de vena umbilical humana 10. Entre ellos HUVEC ganado amplia popularidad debido a su relativa facilidad de aislamiento y la disponibi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Pina Colarusso y el Fondo para la célula de imágenes en vivo por su ayuda con imágenes y análisis de imágenes, la Sra. Lailey por su asistencia técnica, y la unidad 51 en el Hospital Foothills en Calgary, AB para proveer los cables umbilicales humanos. El Dr. Patel es un KD Innova Alberta: Salud Científico de Soluciones. Este trabajo fue apoyado por una subvención de funcionamiento de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y las donaciones de equipos y la infraestructura de la Fundación Canadiense para la Innovación y la Ciencia y la Autoridad de Investigación de Alberta.
Materials
| Reagent and Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it’s all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys – Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
