Mouse Modell av intraluminal MCAO: Cerebral infarct Evaluering av Cresyl Violet Farging

Summary

Den intraluminal midten cerebral okklusjon modell i mus er her presentert. Omfanget av cerebral infarkt er evaluert av en nevrologisk score og Cresyl fiolett flekker, en alternativ flekker til TTC, som tilbyr den store fordelen til å teste i parallelle mange interessegrupper markører.

Abstract

Hjerneslag er den tredje årsak til dødelighet og den ledende årsak til uførhet i verden. Iskemiske hjerneslag står for ca 80% av alle slag. Imidlertid er trombolytisk vevsplasminogenaktivator (tPA) den eneste behandling av akutt hjerneinfarkt som eksisterer. Dette førte forskerne å utvikle flere hjerneinfarkt modeller i en rekke arter. To hovedtyper av gnagere modeller har blitt utviklet: modeller av global cerebral iskemi eller fokale cerebral iskemi. Å etterligne iskemisk slag hos pasienter, i hvorav ca 80% trombotiske eller embolisk hjerneslag inntreffer i territoriet til midten cerebral arterie (MCA), den intraluminal midten cerebral arterie okklusjon (MCAO) modellen er ganske relevant for hjerneslag studier. Denne modellen ble først utviklet i rotter ved Koizumi et al. I 1986 ^1. På grunn av den enkle genetiske manipulasjon i mus, har disse modeller også blitt utviklet i denne arten ^2-3.

innhold "> Heri presenterer vi transient MCA okklusjon prosedyren i C57/Bl6 mus. Tidligere studier har rapportert at fysiske egenskaper sperreinnretningen som spissen diameter, lengde, form og fleksibilitet er kritisk for reproduserbarheten av infarktvolum ^4. Heri, har en kommersiell silisium belagt monofilamenter (Doccol Corporation) blitt brukt. En annen stor fordel er at dette monofilament reduserer risikoen for å indusere subaraknoidal blødninger. Bruke Zeiss stereo-mikroskop STEMI 2000 ble silisium belagt monofilament innført i den interne carotisar (ICA) via et snitt i den eksterne karotidarterie (ECA) inntil monofilamentet occludes basen av MCA. Blodstrøm ble gjenopprettet en time senere ved fjernelse av monofilamentet å etterligne restaurering av blodstrøm etter lysis av en tromboembolisk blodpropp i mennesker. Omfanget av cerebral infarkt kan evalueres først med en neurologisk score og ved måling av den infarktvolum.Iskemiske mus ble dermed analysert for nevrologisk score på ulike post-reperfusjon ganger. Å vurdere infarktvolum, farging med 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid (TTC) ble vanligvis utført. Heri, brukte vi Cresyl fiolett farging siden det gir mulighet til å teste mange kritiske markører ved immunhistokjemi. I denne videoen, rapporterer vi MCAO prosedyre, nevrologiske score og evaluering av infarktvolum ved Cresyl fiolett farging.

Protocol

Forbigående Middle Cerebral arterieokklusjon (MCAO) 1. Kirurgi Prosedyre (Figur 1) Forbigående midtre cerebralarterie okklusjon (tMCAO) utføres på 2 – til 3-måneder gamle hann C57BL / 6 mus (22-28g). Denne protokollen ble godkjent av IRCM bioetikkomité dyr omsorg. Kirurgiske verktøy ble sterilisert ved autoklavering (121 ° C ved 15 psi i 60 min). Mellom hvert dyr, ble de sterilisert bruke varmt limstrengen sterilisatoren (15 sek). Kirurgi bord og annet utstyr er sanitized med 70% etanol. To timer før kirurgi, ble mus analgesized med buprenorfin (0,03 mg / kg bwip). Figur 1A. Dypt anaesthetize mus med isofluran 5% og deretter opprettholde anestesi ved 2,5% isofluran. Kroppstemperatur av musene opprettholdes konstant under operasjonen med en varmepute. Desinfiser pels og skin med 70% etanol eller Betadine. Siden barbering produserer hår fragment utgivelsen, microabrasions og betennelse som kan påvirke slag patofysiologien, har vi ikke barbere musa pels. Gjør en midtlinjen hals snitt og dra forsiktig fra hverandre de myke vev. Under en stereo mikroskop (STEMI 2000, Zeiss), er en stump disseksjon utført for å avdekke luftrøret og trekke musklene for å finne carotisar. Venstre bekken carotisar (CCA) er nøye dissekert fra omkringliggende vev og CCA er midlertidig blokkeres av en midlertidig sutur (1) med 5-0 silke sutur skåret i 20 mm segmenter. Stor forsiktighet bør utvises for ikke å skade vagal nerve. Separer bifurkasjon av venstre interne felles carotisar (ICA) og ekstern felles carotisar (ECA). En permanent sutur (2) plasseres rundt ECA, så distalt som mulig, og en annen midlertidig sutur litt stramt (3) er plassert på ECA distalt forbifurkasjon. Klipp venstre ICA (4) ved hjelp av en omvendt-action pinsett for å unngå blødning. Stor forsiktighet bør utvises for ikke å skade vagal nerve. Klipp et lite hull i ECA (5) mellom faste (2) og midlertidig (3) suturer. Figur 1b. Innføre en 12 mm lang 6-0 silisium-belagt (ca. 9-10mm er belagt silisium) monofilament sutur (Doccol Corporation) i ECA (6), helt kuttet ECA distalt for permanente sutur og invertere avstengertapp inn ICA . Sutur er tett knyttet rundt monofilament for å hindre blødning og omvendt-action pinsett er fjernet. Sperreinnretningen er innført for å occlude opprinnelsen til MCA i sirkelen av Willis. Stoppe sin innsetting rundt 9-10 mm utenfor bifurcation av ECA og CCA. Sperreinnretningen er blokkert og kan ikke flytte lenger. Forsiktighet må utvises for ikke å trenge gjennom pterygopalatine arterien. Sutur (3) på ECA er TIGhtly knyttet til fikse monofilament i posisjon. Lukk huden med en autoclip såret lukkesystem. Injiser 1 ml saltvannsoppløsning subkutant og plassere mus under en infrarød varmelampe under hele etter okklusjon periode (60 min). 2. Restaurering av midtre cerebralarterie Blood Flow Før reanesthesia kan neuroscore kontrolleres for å vurdere effekten av kirurgi. Anesthetize musene som tidligere beskrevet og fjern autoclips. Litt åpne sutur (3) på ECA å tillate monofilament tilbaketrekning og blod reperfusjon. Permanent feste den midlertidige sutur på ECA å forhindre blodtap. Den monofilament holdes for gjenbruk. Fjern den midlertidige sutur (1) på CCA å gi blod resirkulering. Lukke såret. Musene bør få en annen 1 ml saltvannsoppløsning subkutant. Plasser musene under infrarød oppvarming lampe i 1 time. Etter å ha sjekket at dyret gjenvinner mobilitet, er musen tilbake til buret sitt og venstre under varmeputen og håndklær for 72 timer. Merk at bare halvparten av buret er plassert på varmeputen å tillate mus å velge deres miljø. Fordi postoperative vekttap er generelt observert, er most mat plassert i en petriskål å oppmuntre spise. Tolv timer etter kirurgi, mottok musene en annen dose av buprenorfin (0,03 mg / kg bwip). 3. Humbug Drift For sham operasjoner alle prosedyrer er identiske bortsett fra at sperreinnretningen ikke er satt inn. 4. Neuroscore Nevrologiske underskudd tillate evaluering av suksessen tMCAO like etter reperfusjon og senere estimering av graden av alvorlighetsgraden av skaden. Nevrologiske underskudd scoret som tidligere beskrevet 5 </ Sup> og utført ved 1, 24, 48 og 72 timer etter reperfusjon. En utvidet seks punkts skala brukes: 0: normal. 1: mild sirkle atferd med eller uten inkonsekvent rotasjon når plukket opp av halen, <50% forsøk på å roterer motsatt side. 2: mild konsekvent sirkle,> 50% forsøk på å roterer motsatt side. 3: konsekvent sterk og umiddelbar sirkle, holder musen en rotasjon posisjon for mer enn 1-2 sek, med snuten nesten nådde halen. 4: alvorlig rotasjon framdrift i barreling, tap av walking eller refleks. 5: komatøs eller døende. 5. Cresyl Violet Farging (figur 2) Etter PBS-løsning perfusjon er hjerner raskt frosset i isopentan og lagret ved -80 °C. Muse hjerner kan også perfused med 4% paraformaldehyd (PFA) avhengig planlagte immunhistokjemi studiene. Kryostaten-kutt av koronale hjernen seksjoner (17 mikrometer) er utført. Én del av hver 30 samles på samme lysbilde å ha en representant cerebral skade. For volum kvantifisering er to lysbilder farget av Cresyl fiolett flekker og et bilde analysesystem (Scion Corporation, Frederick, MD) ble brukt til å evaluere lesjon. Skaden volum ble beregnet i vilkårlige enheter (piksler), og uttrykt som en prosentandel av den kontralaterale ikke-lesioned område for hver enkelt del. Andre lysbilder holdes ved -80 ° C i immunhistokjemi studier. Alternativt kan PFA-fast hjernen kuttes på 30-50 mikrometer ved hjelp vibratome og infarktvolum målt som anbefales av Han et al. (2009) 6.

Representative Results

The neuroscore evaluation confirms the success of tMCAO post-stroke and determines the efficiency of the tMCAO post-reperfusion. In our hands, all mice subjected to the intraluminal procedure presented at least a mild consistent curling (neuroscore 2) and the neurological deficits are generally stable up to 72 hr. Most mice exhibit a mild consistent curling (neuroscore 2). Mice showing absence of curling are excluded from the study. However, the neuroscore evaluation does not allow us to distinguish between mice with an injured hippocampus and those with an intact hippocampus. No mortality was observed during the surgery day, suggesting that subarachnoid hemorrhages did not occur. When subarachnoid hemorrhage is identified in a mouse, this one is systematically excluded from analysis. The use of silicon-coated monofilament from Doccol Corporation, which is smoother than home-prepared monofilaments, increases the success of tMCAO and reduces subarachnoid hemorrhages. Mortality between 24 hr and 72 hr is 14% in this model, as generally reported for 60 min of occlusion. The mortality observed is probably due to a large infarct volume in this mouse strain. A strong lesion reproducibility has also been observed (standard deviation is 15%), which is very interesting to study neuroprotection molecules where their effect(s) could be hidden by the variability of the model. To evaluate the extent of brain injury following tMCAO, we opted to use cresyl violet staining (Figure 2) rather than TTC in order to have a lot of materials to test relevant markers6. The extent of the lesion is relatively consistent. However, we noticed that in some mice, the hippocampus was injured (around 30% of mice). It is interesting to note that cresyl violet staining can be applied up to 1 week later. In the literature, the percentage of brain infarct varies from one study to the other. It depends on the choice of mouse strain, the anesthesia, the thickness of brain sections, the monofilament used, or the staining used 6, 7. Figure 1. Scheme of the occlusion of the middle cerebral artery using silicon-coated intraluminal monofilament. A. Simplified scheme of mouse brain and cerebral arteries showing successive sutures and clip to prepare the introduction of silicon-coated monofilament. B. The position of monofilament through the circle of Willis is represented. The monofilament is introduced into ICA via ECA to occlude the base of the MCA. ACA, anterior cerebral artery; BA, basilar artery; CCA, common carotid artery; C. Willis, Circle of Willis; ECA, external carotid artery; ICA, internal carotid artery; MCA, middle cerebral artery; PCA, posterior communicating artery; PPA, pterygopalatine artery. Figure 2. Representative coronal sections of mouse brain stained with cresyl violet after 72 hr post-reperfusion. Infarct area (mainly striatum, cortex and adjacent brain areas) appears in white (unstained by cresyl violet). The injury volume (white part, right hemisphere) was delimited and expressed as a percentage of the contralateral non-lesioned area (left hemisphere).

Discussion

Ulike takts modellene er utviklet for å etterligne hjerneslag konsekvenser hos pasienter. Valget av den firetaktsmotor avhenger biologiske spørsmålet. Den intraluminal MCAO modellen etterligner en av de mest vanlige typer av iskemisk slag hos pasienter og er mindre invasiv og mer konsistent enn Tamura modellen ^4,7. Det er en veldig interessant modell for neuroprotection, neurorepair og celledød analyser. Suksessen av intraluminal modellen avhenger av mange faktorer, slik som animalsk kjønn, alder og vekt, temperatur, anestesi og tidspunktet for kirurgi, som må bli kontrollert. De fysiske proprieties av sperreinnretningen (tips diameter, lengde, form og fexibility) er kritisk for konsistensen av MCAO ^4. Heri, bruker vi 12 mm lange 6-0 monofilament belagt med silikon på 9-10 mm fra Doccol Corporation. Den store fordelen med denne monofilament er å redusere subaraknoidal blødninger og fordi dens lengde dekket alle ICAlengde, gjenværende blodstrøm, som kommer fra fremre og bakre kommunisere arteriene Circle of Willis og PPA, forhindres og variasjon i infarktvolum reduseres (15% av variasjonen i våre hender) ^8. Sutur av CCA reduserer også variabiliteten i det infarktvolum ^9.

Omfanget av hjerneskade følgende tMCAO kan vurderes ved forskjellige måter. Nevrologiske underskudd kan måles som tidligere nevnt. Imidlertid er det vanskelig å ha et effektivt tiltak ved denne måten. Omfanget av infarktet er ofte utført av TTC farging. Mer nylig, er magnetisk resonans teknikker også brukt, et spesielt interessant teknologi for neurobeskyttende behandlinger. For å forstå de underliggende cellulære mekanismene som er involvert i slag som neurorepair, celledød eller celleproliferasjon, er studiet av ulike markører ved immunhistokjemi kritisk og meget informativ. Dermed vår protocol av hjernen delen forberedelsene har den store fordelen at disse analysene, og reduserer antall mus som brukes. Videre Tureyen et al. ^Ti har rapportert at det er god korrelasjon mellom Cresyl fiolett flekker og TTC.

Materials

Description	Company	Catalogue number
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000
Fiber-Light High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.
Anesthesia system for isoflurane
Isoflurane	CDMV	108737
Heating blanket	Gaymar Medsearch	TP22G
Infrared heating lamp
Ultra fine tweezers, style 5	Electron Microscopy Sciences	78320-5TI
Vannas Scissors 3 mm Cutting Edge, Straight	Electron Microscopy Sciences	72932-01
Style LA-1 and MPF-1 All smooth blades	Electron Microscopy Sciences	77926-5S
Negative action tweezers, style KOPINC 5	Electron Microscopy Sciences	72850-F
Dissecting scissors 5 1/2″ Straight	Cedarlane	72960
Autoclip starter set	Harvard apparatus	34-0557
BD Autoclip Wound Closing Syst., 9mm long,100/pk	Fisher	01-804-5
5-0 suture	Harvard apparatus	517763
Suture material PDS II monofilament violet, 5-0, RB-1; Z303H	CDMV	6167
12 mm-long 6-0 silicon-coated monofilament suture	Doccol Corporation	60SPRePK5
Seringes 1ml	Fisher	14-823-2F
Needles 26G1/2	Fisher	BD-305111
C57BL/6 mice	IRCM