Transplantation d'îlots pancréatiques dans la capsule du rein de souris diabétiques
Summary
Notre protocole a été développé pour offrir proprement et facilement les îlots ou de cellules sous la capsule rénale de souris. Les cellules sont concentrées en granules dans le tube final utilisé pour la transplantation des cellules sous la capsule rénale. La facilité de cette technique réduit le stress pour les cellules et la souris.
Abstract
Notre protocole a été développé pour offrir proprement et facilement les îlots ou de cellules sous la capsule rénale de souris diabétiques ou normale. Nous avons trouvé qu'il était plus facile de concentrer les îlots ou de cellules en granules dans le tube de livraison finale (PE50) utilisé pour la transplantation des cellules sous la capsule rénale. Cette technique offre à la fois rapidité et la facilité tout en réduisant les stress indu aux cellules ou à la souris.
Chargement: Installé, cueillies à la main, d'îlots ou de cellules granulées sont soigneusement aspiré au fond d'un microtube de 1,5 ml en utilisant un pipetteman P200 et une droite, à paroi fine pointe de la pipette. Une longueur de tube PE50 est attaché à la pointe de la pipette en utilisant un tube en silicone petites adaptateur. Les cellules sont autorisés à s'installer, dans la pointe, puis sont transférés à la tubulure PE50 par lentement composant le pipetteman. Une fois les cellules vers la fin du tube PE50, un coude est faite et le tube de silicone adaptateur est placé sur le pli. Le tube PE50 est transféré à un 15 ml conique contenant une pipette ml couper 5, et le tube PE50 est enregistrée sur le côté de la pipette 5 ml d'éviter de curling lors de la centrifugation. Les cellules sont autorisés à atteindre 1000 rpm et s'arrêta.
Transplantation: souris receveuses sont anesthésiés, rasés et nettoyés. Une petite incision est faite sur le flanc gauche de la souris et le rein est exposé. Le rein, la graisse et les tissus sont maintenus humides avec un tampon saline normale. L'extrémité distale de la PE50 est attachée à une seringue Hamilton entraînement à vis, contenant une pipette, en utilisant le tube adaptateur en silicone. Une petite incision est faite sur le côté flanc droit du rein, pas trop grand ni trop profonde. L'extrémité biseautée du tube PE50, plus proche des cellules, est soigneusement placé sous la capsule, le tube est déplacé autour doucement pour faire de l'espace tout en tamponnant une solution saline normale; une capsule sèche peut se déchirer facilement. Une petite bulle d'air est livré sous la capsule par lentement numérotation du lecteur vis de la seringue. Les îlots sont ensuite lentement livré derrière la bulle d'air. Une fois l'homéostasie du rein les îlots ont été livrés est maintenue et le bric est cautérisée à basse température. Le rein est placé dans la cavité et le péritoine et la peau sont suturés et agrafées. Les souris sont immédiatement traités avec flunixine et la buprénorphine carrés et placé dans une cage sur un coussin chauffant.
Protocol
Discussion
Ce protocole prévoit une option pratique et efficace pour la prestation proprement et facilement les îlots ou de cellules sous la capsule rénale de souris diabétiques ou normale. La technique de concentration et de granulation des îlots ou de cellules dans la tubulure de livraison finale (PE50) utilisé pour la transplantation des cellules sous la capsule rénale offre une méthode facile et efficace de la transplantation de cellules, tout en réduisant les stress indu aux cellules ou à la souris.
Acknowledgements
UCSF Diabetes Center. NIH UCSF DERC Islet Core. FRDJ. LifeScan Inc Johnson & Johnson Company.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Surgical gloves | Fisher | 11-394-95(sz) | ||
| Surgical scrub sponges | Moore medical | 42940AK | ||
| Forceps | Miltex | 6-114 and 6-26 | 2 with teeth, 2 straight | |
| Dissecting scissors n=2 | Miltex | 5-290 | ||
| Oster razor (sz. 40 blade) | Fisher | 01-305-10B | ||
| 4×4 Sterile gauze pads | Moore Medical | 08252AK | ||
| Povidone Iodine pads | Moore Medical | 08486AK | ||
| Alcohol pads | Fisher | 14-819-2 | ||
| Heating pad | Moore Medical | 42508AK | ||
| 23G or 25G needles | 1″ long | |||
| Cidex solution | Moore Medical | 07535AK | for cleaning/santizing instruments | |
| PE50 polyethylene tubing | BD | 427411 | PE50, 0.965mm O.D. x 0.58mm I.D. | |
| Cidex + 28 day soln | Moore | 35625AK | ||
| Silicone tubing | Spectrum Chromat. | 123732 | 5/32”OD x 1/32” ID | |
| Instrument sterilizing container | Moore Medical | 39074AK | ||
| Straight Pipet Tips | TipOne | 1111-0810 | sterile | |
| Glass syringe w/screw-drive | Hamilton | 1001 | ||
| Cauterizing tool | Roboz | RS230 | ||
| Needle Holder | Moore Medical | 41-067 | ||
| 5-0 silk | Look | 754B | for suture (6-C) | |
| Cotton tipped swab | Moore Medical | |||
| 9mm autoclip stapler | BD | 7630 | ||
| 9mm staples | BD | 7631 | ||
| 9mm staple remover | BD | 7637 |
References
- Tang, Q., Henriksen, K. J., Bi, M., Finger, E. B., Szot, G., Ye, J., Masteller, E. L., McDevitt, H., Bonyhadi, M., Bluestone, J. A. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Rulifson, I. C., Szot, G. L., Palmer, E., Bluestone, J. A. Inability to induce tolerance through direct antigen presentation. Am J Transplant. 2, 510-519 (2002).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Hathcock, K. S., Zuckerman, L. A., Freeman, G., Thistlethwaite, J. R., Gray, G. S., Hodes, R. J., Bluestone, J. A. Inhibition of transplant rejection following treatment with anti-B7-2 and anti-B7-1 antibodies. Transplantation. Transplantation. 60, 1171-1178 (1995).
- Lenschow, D. J., Zeng, Y., Thistlethwaite, J. R., Montag, A., Brady, W., Gibson, M. G., Linsley, P. S., Bluestone, J. A. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4lg. Science. 257, 789-792 (1992).
