Diffus fluorescens tomografi giver en relativt lav pris og høj-løbet fremgangsmåde prækliniske<em> In vivo</em> Tumorafbildning. Metoden i optiske dataopsamling, kalibrering og billedet genopbygning præsenteres for en computerstyret tomografi-guidet berøringsfri tidsdomæne-system med fluorescerende målretning af tumoren biomarkør epidermal vækstfaktor-receptor i en mus gliom model.
Lille dyr fluorescens molekylær billeddannelse (FMI) kan være et effektivt redskab til præklinisk forsknings-og udviklingsprojekter undersøgelser 1. Imidlertid lysabsorption væv kromoforer (f.eks hæmoglobin, vand, lipider, melanin) typisk begrænser optiske signal udbredes gennem tykkelser større end nogle få millimeter 2. Sammenlignet med andre synlige bølgelængder, vævsabsorption for rød og nær-infrarøde (nær-IR) lysabsorption dramatisk reducerer ikke-elastisk lysspredning bliver dominerende lys-væv interaktion mekanisme. Den relativt nylige udvikling af fluorescerende stoffer, som absorberer og udsender lys i det nær-IR området (600-1000 nm), har drevet udvikling af billeddannende systemer og lysudbredelsen modeller, som kan opnå hele kroppen tredimensional billeddannelse i små dyr 3.
På trods af store fremskridt på dette område, stadig dårligt stillet karakter af diffus fluorescens tomografi en betydeligproblem for stabilitet, kontrast nyttiggørelse og rumlig opløsning af billeddata genopbygning teknikker og den bedste tilgang til FMI i små dyr er endnu ikke enige om. Størstedelen af forskergrupper har investeret i charge-coupled device (CCD)-baserede systemer, der giver rigelig vævs-prøvetagning, men suboptimal følsomhed 4-9, mens vores gruppe og et par andre 10-13 har forfulgt systemer baseret på meget høj følsomhed detektorer , at på dette tidspunkt give tætte væv prøveudtagning kan kun opnås på bekostning af lave billedbehandling gennemløb. Her har vi demonstrere metoden for anvendelse af enkelt-foton detektionsteknologi i et fluorescens tomografi system til at lokalisere en kræftsvulst hjernen læsion i en musemodel.
Fluorescens tomografi (FT) anvendte system enkelt foton tælling under anvendelse fotomultiplikatorrør (PMT) og information-rige tidsdomæne lysdetektion i en ikke-kontakt konformation 11. Dette tilvejebringer en samtidig collektion af transmitteret excitation og emission lys, og omfatter automatisk fluorescens excitation eksponeringskontrol 14, laser henvisninger, og co-registrering med et lille dyr computertomografi (microCT) system 15. En nøgen musemodel blev anvendt til billeddannelse. Dyret blev inokuleret orthotopisk med en human glioma cellelinie (U251) i venstre cerebrale hemisfære og afbildes 2 uger senere. Tumoren blev fremstillet til at fluorescere ved injektion af et fluorescerende sporstof, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) er målrettet mod epidermal vækstfaktorreceptor, en cellemembran-protein kendt for at være overudtrykt i U251 tumorlinie og mange andre cancerformer 18. En anden, ikke-målrettede fluorescerende sporstof, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) blev også injiceret med hensyn til ikke-receptor-medierede virkninger på optagelsen af de målrettede sporstoffer for at tilvejebringe et middel til at kvantificere sporstof binding og receptor tilgængelighed / densitet 27. En CT-guidet, time-domænet algoritme blev anvendt til at rekonstruere placering af både fluorescerende sporstoffer (dvs. placering af tumor) i musehjerne og deres evne til at lokalisere tumoren blev verificeret ved kontrastforstærket magnetisk resonans billeddannelse.
Selvom påvist fluorescensimagografi i en gliom musemodel kan metoden præsenteret i denne video udvides til forskellige tumormodeller i forskellige små dyremodeller potentielt op til størrelsen af en rotte 17.
Fluorescens tomografi (FT) er en følsom, ioniserende stråling fri molekylær afbildningsmodalitet baseret på synlige og nær-infrarødt lys transporten gennem biologisk væv. Det meste af interesse i FT har været fokuseret på dets potentiale til at fremskynde lægemiddelforskning og-udvikling i små dyre eksperimentelle modeller 1 og en centralt område af forskning har været studiet af kræft biomarkør udtryk og respons til molekylære behandlinger 26. På nuværende tidspunkt er der to konkurrerende tilgange til FT system design. Den mest almindelige design er baseret på afkølede charge-coupled device (CCD) kamera til fluorescenspåvisning 4-9. Denne udformning giver en høj tæthed af målinger for at maksimere væv prøveudtagning, idet hver pixel i CCD-kameraet kan detektere lys, der har udbredt sig en unik sti gennem vævet. Men, CCD-kameraer har et begrænset dynamikområde og udlæsning støj begrænser deres ultimative følsomhed. Den anden konstruktion undgår den potentielle begræns tioner af CCD-kamera detektering ved anvendelse af meget følsomme enkelt-foton optælling teknologi baseret på anvendelsen af sådanne detektorer med fotomultiplikatorrør eller avalanche fotodioder 10-13. Ulempen ved disse mere følsomme metoder til påvisning, at hver detektor kun kan samle lys ved et enkelt punkt, således at opnå tæt væv sampling, enten mange detektorer skal anvendes (som er meget dyrt), eller mange fremspring skal afbildes med den samme detektor (hvilket kan være tidskrævende). Mens det optimale niveau af væv stikprøver af små dyr, FT ikke er aftalt, og kan variere fra sag til sag, er det aftalt, at single-photon tælling instrumentering er bedre egnet til at udforske følsomhed grænserne for FT i form dens evne til at detektere lave koncentrationer af molekylære markører. I denne undersøgelse tilvejebringer vi en metode til udførelse FT anvendelse af enkelt-foton tælling detektering instrumentering til at lokalisere tumorer i mus.
ent "> Der er fire kritiske trin involverede fremstilling af robuste datasæt med tid korrelerede enkelt-foton tælle FT. Den første er anvendelsen af et egnet og ligetil kalibreringsproceduren. I præsenterede metode, er de respektive følsomhed hver detektionsafsætning kanal tegnede ved indsamling af en basislinie måling af exciterende lys transmitteret gennem en ledning-diffusor udformet til at rette lige store fraktioner af lys til hver detektor 15. Endvidere er det detekterede lys i et eksperiment kontinuerligt kalibreret til laseren reference, både intensitet og betyder . tid, som kunne svinger over tid, ved drift af en laser henvisning kanal 11,15 Det andet afgørende skridt er den præcise indsamling og co-registrering af anatomiske billeddannelse til guidede fluorescens rekonstruktioner FT data alene giver ingen anatomiske oplysninger. Derfor, for at skabe en model af lys transport, kan anvendes til at rekonstruere lodelse af fluorescerende kilder i en prøve fra den detekterede fluorescens ved overfladen af prøven skal anatomi af prøven i forhold til FT system kendes nøjagtigt. I vores system, er det anatomiske oplysninger indhentet ved en mikro-computertomografi system med rumlige koordinater, der er blevet rumligt registreret hos dem i FT-system 15,20. Den tredje afgørende skridt indebærer at sikre, at en optimal eksponering (dvs. total foton afsløring tid til hver laser projektion) er ansat ved hver kilde-detektor position. Dette er vigtigt af to grunde: For det første at sikre, at der er tilstrækkelig signal-støj i hver afsløring position og for det andet for at undgå detektor mætning, hvilket kan beskadige opdagelse enheder. For at opnå optimal eksponering ved hver detektor position, er en automatisk eksponering anvendes, som i det væsentlige triangulates optimal eksponering fra to lav-signal eksponeringer 14. Den fjerde kritisketrin af metode refererer til de indsamlede fluorescens data til mængden af transmitteret excitationslys. Dette henvisninger kaldes ofte Født forholdet, og giver mange fordele for FT, med det vigtigste er en begrænsning af model-data mismatch fejl 23,24. De præsenterede Systemet blev designet til at detektere både fluorescens og transmitteres excitationslys samtidigt ved kanalisering af lys i hver detektionsafsætning kanal i 2 separate fotomultiplikatorrør. Ved at gøre dette, undgår vi eventuelle virkninger af bevægelse på nøjagtigheden af Born forholdet.Med et robust datasæt den side indebærer billede genopbygning af tid-domæne data løse det inverse problem med Finite Element maske med udtrykket:
d = Jx
hvor d er en vektor med n x m elementer til N-kilde-detektor fremspring og m TPSF tid porte, J er en n x m-by-l følsomhed matrix (eller Jacobian) til l knudepunkter i nettet, og x er vektoren af fluorescens optiske egenskaber i hvert knudepunkt, der størrelse l d er de kalibrerede data opsamlet under eksperimentet, og J er simuleret ved hjælp af finite element opløsningen. til tidsdomænet diffusion tilnærmelse af fluorescens transport 25. Tid-dimension J også foldet med detektoren instrumentspecifikke responsfunktioner. X er en repræsentation af fluorescens kort af interesse og løses for at anvende et Levenberg-Marqardt ikke-negative mindste kvadraters metode med Tikhonov regularisering 15.
Metoden præsenteret her, som beskriver en fremgangsmåde i stand til at lokalisere fluorescensmærkede tumorer i mus under anvendelse af stærkt følsomme foton tælle fluorescenspåvisning, har potentialet til at skubbe grænserne for FT. I en tidligere undersøgelse under anvendelse af potentialettilgang i større-end-mus dyr modeller, såsom rotter, samt forbedret følsomhed i forhold til eksisterende system design i muse-størrelse prøver, blev påvist 17. Den umiddelbare anvendelse af denne fremgangsmåde ville være for overvågning af biomarkør udtryk in vivo i små dyretumormodeller at vurdere lægemidlet effekt i en high-throughput midler. Evnen af systemet til at excitere og detektere fluorescens ved flere bølgelængder muliggør samtidig påvisning af multiple fluorescerende markører. Yderligere fluorescerende markører tilvejebringe et middel til udspørgende flere aspekter af en patologi, samtidig eller kan anvendes, som i denne undersøgelse, at anvende mere kvantitative billeddannende fremgangsmåder såsom dobbelt reporter metoder til måling af in vivo binding potentiale, en markør for receptoren densitet 26,27.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er finansieret af National Cancer Institute tilskud R01 CA120368 og R01 CA109558 (KMT, RWH, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) og K25 CA138578 (FL), og canadiske Institutes of Health Research postdoc stipendium pris (KMT ). Udviklingen af fluorescens tomografi systemet blev delvist finansieret af Advanced Research Technologies (Montreal, QC).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
IRDye 800CW-EGF | LI-COR Biosciences | 926-08446 | |
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester | Life Technologies | A20106 | Reacted with water to minimize non-specific binding |