फैलाना प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी preclinical करने के लिए एक अपेक्षाकृत कम लागत और संभवतः उच्च भर दृष्टिकोण प्रदान करता है<em> Vivo में</em> ट्यूमर इमेजिंग. ऑप्टिकल डेटा संग्रह, अंशांकन, और छवि के पुनर्निर्माण की कार्यप्रणाली गणना टोमोग्राफी निर्देशित गैर संपर्क समय डोमेन ट्यूमर biomarker के एक माउस glioma मॉडल के में epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर के फ्लोरोसेंट लक्ष्यीकरण का उपयोग कर प्रणाली के लिए प्रस्तुत किया है.
Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light absorption by tissue chromophores (e.g., hemoglobin, water, lipids, melanin) typically limits optical signal propagation through thicknesses larger than a few millimeters2. Compared to other visible wavelengths, tissue absorption for red and near-infrared (near-IR) light absorption dramatically decreases and non-elastic scattering becomes the dominant light-tissue interaction mechanism. The relatively recent development of fluorescent agents that absorb and emit light in the near-IR range (600-1000 nm), has driven the development of imaging systems and light propagation models that can achieve whole body three-dimensional imaging in small animals3.
Despite great strides in this area, the ill-posed nature of diffuse fluorescence tomography remains a significant problem for the stability, contrast recovery and spatial resolution of image reconstruction techniques and the optimal approach to FMI in small animals has yet to be agreed on. The majority of research groups have invested in charge-coupled device (CCD)-based systems that provide abundant tissue-sampling but suboptimal sensitivity4-9, while our group and a few others10-13 have pursued systems based on very high sensitivity detectors, that at this time allow dense tissue sampling to be achieved only at the cost of low imaging throughput. Here we demonstrate the methodology for applying single-photon detection technology in a fluorescence tomography system to localize a cancerous brain lesion in a mouse model.
The fluorescence tomography (FT) system employed single photon counting using photomultiplier tubes (PMT) and information-rich time-domain light detection in a non-contact conformation11. This provides a simultaneous collection of transmitted excitation and emission light, and includes automatic fluorescence excitation exposure control14, laser referencing, and co-registration with a small animal computed tomography (microCT) system15. A nude mouse model was used for imaging. The animal was inoculated orthotopically with a human glioma cell line (U251) in the left cerebral hemisphere and imaged 2 weeks later. The tumor was made to fluoresce by injecting a fluorescent tracer, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) targeted to epidermal growth factor receptor, a cell membrane protein known to be overexpressed in the U251 tumor line and many other cancers18. A second, untargeted fluorescent tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) was also injected to account for non-receptor mediated effects on the uptake of the targeted tracers to provide a means of quantifying tracer binding and receptor availability/density27. A CT-guided, time-domain algorithm was used to reconstruct the location of both fluorescent tracers (i.e., the location of the tumor) in the mouse brain and their ability to localize the tumor was verified by contrast-enhanced magnetic resonance imaging.
Though demonstrated for fluorescence imaging in a glioma mouse model, the methodology presented in this video can be extended to different tumor models in various small animal models potentially up to the size of a rat17.
प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी (एफटी) एक संवेदनशील, विकिरण मुक्त आणविक इमेजिंग जैविक ऊतक के माध्यम से दिखाई और लगभग अवरक्त प्रकाश परिवहन पर आधारित साधन है. एफटी में ब्याज की अधिकांश छोटे पशु प्रयोगात्मक 1 मॉडल और एक शोध के प्रमुख क्षेत्र कैंसर biomarker अभिव्यक्ति और आणविक 26 उपचार के लिए प्रतिक्रिया का अध्ययन किया गया है में दवाओं की खोज और विकास में तेजी लाने की क्षमता पर ध्यान केंद्रित किया गया. वर्तमान में, वहाँ दो एफटी प्रणाली डिजाइन करने के लिए प्रतिस्पर्धा दृष्टिकोण हैं. सबसे आम डिजाइन ठंडा प्रतिदीप्ति 4-9 पता लगाने के लिए प्रभारी युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरों पर आधारित है. इस डिजाइन माप की एक उच्च घनत्व प्रदान करता है, सीसीडी कैमरे में प्रत्येक पिक्सेल के बाद से ऊतक के नमूने अधिकतम प्रकाश है कि ऊतक के माध्यम से कूच किया है एक अद्वितीय पथ का पता लगा सकते हैं. हालांकि, सीसीडी कैमरों एक सीमित गतिशील रेंज है और पढ़ने के बाहर शोर उनके परम संवेदनशीलता की सीमा. दूसरा डिजाइन संभावित limita से बचा जाता है सीसीडी कैमरे का पता लगाने के अति संवेदनशील एकल फोटोन गिनती photomultiplier ट्यूबों या हिमस्खलन photodiodes 10-13 जैसे डिटेक्टरों के उपयोग पर आधारित प्रौद्योगिकी को रोजगार से माहौल. इन अधिक संवेदनशील तरीकों का पता लगाने का दोष यह है कि प्रत्येक डिटेक्तार केवल एक ही बिंदु पर प्रकाश इकट्ठा कर सकते हैं, इसलिए, घने ऊतक के नमूने प्राप्त करने के लिए, या तो कई डिटेक्टरों (जो बहुत महंगा है) इस्तेमाल किया जा है, या कई अनुमानों imaged किया जा साथ ही डिटेक्टर (जो काफ़ी समय हो सकता है). जबकि छोटे जानवर एफटी के लिए ऊतक के नमूने का इष्टतम स्तर पर नहीं सहमत हो गया है, और एक मामले दर मामले के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, इस बात पर सहमति है कि एकल फोटॉन गिनती उपकरण बेहतर करने के लिए संदर्भ में एफटी की संवेदनशीलता सीमा का पता लगाने के लिए अनुकूल है इसके लिए आणविक मार्करों के कम सांद्रता का पता लगाने की क्षमता की. इस अध्ययन में, हम बाहर ले जाने एफटी एकल फोटॉन गिनती का पता लगाने के उपकरण का उपयोग करने के लिए चूहों में ट्यूमर स्थानीयकरण के लिए एक पद्धति प्रदान करते हैं.
"ईएनटी> वहाँ चार महत्वपूर्ण कदम समय सहसंबद्ध एकल फोटॉन गिनती एफटी के साथ मजबूत डेटासेट का उत्पादन करने के लिए शामिल हैं. पहले एक उपयुक्त और सरल अंशांकन प्रक्रिया के आवेदन है. प्रस्तुत पद्धति में प्रत्येक पहचान चैनल के संबंधित संवेदनशीलता जिम्मेदार हैं उत्तेजना के लिए प्रत्येक 15 डिटेक्टर करने के लिए प्रकाश के समान भिन्न प्रत्यक्ष लाइन diffusor के माध्यम से प्रेषित प्रकाश की एक आधारभूत माप इकट्ठा करके इसके अलावा, एक प्रयोग के दौरान पता चला प्रकाश लगातार लेजर संदर्भ के लिए calibrated है, और दोनों तीव्रता के संदर्भ में मतलब . समय है, जो समय के साथ लेजर संदर्भ 11,15 चैनल के संचालन से उतार चढ़ाव हो सकता है, दूसरा महत्वपूर्ण कदम सही और निर्देशित प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण के लिए संरचनात्मक इमेजिंग की सह पंजीकरण संग्रह है एफटी डेटा अकेले कोई संरचनात्मक जानकारी प्रदान करता है. इसलिए, क्रम में प्रकाश परिवहन की एक मॉडल बनाने के लिए कि लो फिर से संगठित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैनमूना की सतह पर पाया प्रतिदीप्ति से एक नमूना के भीतर फ्लोरोसेंट स्रोतों के कटियन, एफटी प्रणाली के संबंध में नमूना की शारीरिक रचना सही जाना चाहिए. हमारी प्रणाली में संरचनात्मक जानकारी स्थानिक निर्देशांक कि स्थानिक एफटी 15,20 प्रणाली की उन के साथ पंजीकृत किया गया है के साथ एक माइक्रो – गणना टोमोग्राफी प्रणाली के द्वारा प्राप्त किया जाता है. तीसरा महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि एक इष्टतम प्रदर्शन (यानी, कुल फोटान का पता लगाने के समय प्रत्येक लेजर प्रक्षेपण के लिए) स्रोत डिटेक्टर हर स्थिति में कार्यरत है शामिल है. यह दो कारणों से महत्वपूर्ण है: पहला, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक का पता लगाने की स्थिति में संकेत करने के लिए पर्याप्त शोर और दूसरे के लिए डिटेक्टर संतृप्ति है, जो पता लगाने इकाइयों को नुकसान पहुंचा सकता है से बचने के है. आदेश में प्रत्येक डिटेक्टर स्थिति में इष्टतम जोखिम को प्राप्त करने के लिए, एक स्वत: जोखिम नियंत्रण में कार्यरत है, जो अनिवार्य रूप से दो, कम संकेत जोखिम 14 से इष्टतम प्रदर्शन triangulates. 4 महत्वपूर्णपद्धति का कदम प्रेषित उत्तेजना प्रकाश की मात्रा में एकत्र प्रतिदीप्ति डेटा को संदर्भित है. यह संदर्भित जन्मे अनुपात अक्सर कहा जाता है, और मुख्य मॉडल डेटा बेमेल त्रुटियों 23,24 शमन जा रहा है एक के साथ एफटी के लिए कई लाभ प्रदान करता है. प्रस्तुत प्रणाली के लिए 2 अलग photomultiplier ट्यूबों में प्रत्येक का पता लगाने के चैनल में प्रकाश channeling द्वारा दोनों प्रतिदीप्ति और प्रेषित उत्तेजना प्रकाश एक साथ पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया था. ऐसा करने से, हम जन्मे अनुपात की सटीकता पर गति के प्रभाव से बचने के.एक मजबूत डाटासेट यह हाथ के साथ, समय – डोमेन डेटा की छवि के पुनर्निर्माण परिमित तत्व अभिव्यक्ति होने के जाल के व्युत्क्रम समस्या को हल करना शामिल है:
घ = JX
जम्मू एक n x मीटर है, पता स्रोत डिटेक्टर अनुमानों मीटर और TPSF से समय फाटकों के लिए n एक्स मीटर तत्वों के साथ एक सदिश हैएल (या Jacobian) के संवेदनशीलता मैट्रिक्स, जाल में मैं नोड्स के लिए, और एक्स प्रत्येक नोड में प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल संपत्तियों की वेक्टर आकार एल डी है कैलिब्रेटेड प्रयोग और जम्मू के दौरान एकत्र डेटा नकली है परिमित तत्व समाधान का उपयोग है. प्रतिदीप्ति 25 परिवहन के समय डोमेन प्रसार सन्निकटन. डिटेक्टर विशिष्ट साधन प्रतिक्रिया के कार्यों के साथ जम्मू के समय आयाम भी है convolved एक्स ब्याज की प्रतिदीप्ति नक्शे के एक प्रतिनिधित्व है और Tikhonov नियमितीकरण के साथ 15 Levenberg – Marqardt गैर नकारात्मक कम से कम वर्गों दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए हल है.
कार्यप्रणाली यहाँ प्रस्तुत है, जो एक अत्यधिक संवेदनशील गिनती फोटॉन प्रतिदीप्ति का पता लगाने का उपयोग करते हुए चूहों में ट्यूमर स्थानीयकृत fluorescently लेबल में सक्षम प्रक्रिया का वर्णन, एफटी की सीमा बढ़ाने की क्षमता है. पिछले एक अध्ययन में, की क्षमता को रोजगारदृष्टिकोण से बड़े चूहों चूहों, साथ ही साथ माउस आकार के नमूनों में मौजूदा प्रणाली डिजाइन पर सुधार संवेदनशीलता जैसे जानवरों मॉडल, में, 17 प्रदर्शन किया गया. इस दृष्टिकोण की तत्काल आवेदन biomarker अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए एक उच्च throughput साधन में दवा की प्रभावकारिता का मूल्यांकन छोटे पशु ट्यूमर मॉडल में vivo में होगा. प्रणाली की क्षमता को उत्तेजित और कई तरंग दैर्ध्य में प्रतिदीप्ति का पता लगाने के कई फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ – साथ पता लगाने की अनुमति देता है. अतिरिक्त फ्लोरोसेंट मार्करों एक विकृति के कई पहलुओं से पूछताछ, एक साथ, या, जैसा कि इस अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता का एक साधन प्रदान करते हैं, vivo में बाध्यकारी क्षमता को मापने के दोहरे संवाददाता तरीकों, रिसेप्टर घनत्व के एक मार्कर के रूप में अधिक मात्रात्मक इमेजिंग दृष्टिकोण को रोजगार 26,27.
The authors have nothing to disclose.
यह काम राष्ट्रीय कैंसर संस्थान R01 CA120368 अनुदान, CA109558 R01 (KMT, वर्षा जल संग्रहण, FEG, BWP), RO1 (एम.जे., BWP) CA132750 और CA138578 K25 (FL) द्वारा वित्त पोषित किया गया है, और स्वास्थ्य अनुसंधान postdoctoral फैलोशिप पुरस्कार के कनाडाई संस्थानों (KMT ). प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी प्रणाली का विकास आंशिक रूप से एडवांस्ड रिसर्च टेक्नोलॉजीज (मॉन्ट्रियल, QC) द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
IRDye 800CW-EGF | LI-COR Biosciences | 926-08446 | |
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester | Life Technologies | A20106 | Reacted with water to minimize non-specific binding |