تلوين المناعى من H1-B7 (PD-L1) على البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج الشرائح غدية البنكرياس
Summary
B7-H1 (PD-L1) وملزمة لPD-1 توفير الرئيسية الورم الناجم عن مناعة في إشارة المكروية الورم. يوصف تلطيخ المناعى تقنية لتوصيف التعبير وتوطين H1-B7 غدية البنكرياس في هنا.
Abstract
B7-H1/PD-L1، وهو عضو في عائلة من البروتينات B7 سطح الخلية المناعية التنظيمية، ويلعب دورا هاما في تنظيم السلبية للخلية بوساطة الاستجابات المناعية من خلال تفاعلها مع مستقبلات لها، برمجة موت-1 (PD -1) 1،2. وقد لوحظ overexpression من H1-B7 من قبل الخلايا السرطانية في عدد من السرطانات البشرية، بما في ذلك سرطان الجلد، ورم أرومي دبقي، وسرطان في الرئة، وسرطان الثدي والمبيض والقولون والكلى والخلايا، وتبين أنها لإضعاف المضادة للورم T- الحصانة الخلية 3-8.
مؤخرا، تم التعرف B7-H1 أنسجة غدية التعبير البنكرياس كعلامة النذير المحتملة 9،10. بالإضافة إلى ذلك، وقد تبين من الحصار H1-B7 في نموذج الفأر من سرطان البنكرياس لإنتاج استجابة المضادة للورم 11. هذه البيانات تشير إلى أهمية H1-B7 كهدف العلاجية المحتملة. ولذلك فإن الأجسام المضادة لمكافحة الحصار B7-H1 التي يجري اختبارها في التجارب السريرية لمولtiple الأورام الصلبة بما في ذلك سرطان الجلد البشري وسرطان والرئة والقولون، والمعدة والكلى والبنكرياس 12.
من أجل أن تكون في نهاية المطاف قادرا على تحديد المرضى الذين سيستفيدون من H1-B7 استهداف العلاجات، فمن الأهمية بمكان للتحقيق في العلاقة بين التعبير وتوطين H1-B7 واستجابة المريض للعلاج الأجسام المضادة مع الحصار B7-H1. ودراسة التعبير عن H1-B7 في الأنسجة البشرية غدية البنكرياس من خلال المناعية إعطاء فهم أفضل لكيفية هذا الجزيء يشير شارك في المثبطة يسهم في قمع الحصانة انتيتومور في المكروية الورم. وقد تبين أن الأجسام المضادة لمكافحة B7-H1 وحيدة النسيلة (استنساخ 5H1) التي وضعها تشن وزملاء العمل لتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها في تلطيخ cryosections من أنواع متعددة من الأورام الأنسجة البشرية 4،8، ولكن تلطيخ على شرائح-البارافين جزءا لا يتجزأ من كان تحديا حتى مؤخرا 13-18. لدينا ديفهربت بروتوكول B7-H1 تلطيخ للشرائح البارافين، جزءا لا يتجزأ من أنسجة غدية البنكرياس. بروتوكول B7-H1 تلطيخ الموصوفة هنا تنتج متسقة تلطيخ الغشائي وحشوية من H1-B7 مع الخلفية قليلا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم إبلاغ الإدارة عن تلطيخ المناعى من H1-B7 على cryosections في الدراسات السابقة لمجموعة متنوعة من أنواع السرطان 3،4. ومع ذلك، وعينات الورم السريرية عادة ما تكون متاحة فقط في شكل كتل البارافين، جزءا لا يتجزأ من. وقد تم في الآونة الأخيرة على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 5H…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EB، KMB، وHX المساهمة على قدم المساواة. وأيد هذه الدراسة من قبل لجنة التحقيق الوطنية SPORE في سرطانات الجهاز الهضمي P50 CA062924، NIH K23 CA148964، ومؤسسة Lustgarten، مؤسسة Viragh، ASCO جائزة الباحث الشاب، NIH-28 5T32 CA0090701 التدريب غرانت، سول سرطان البنكرياس مركز جولدمان، والمؤسسة الوطنية للبنكرياس.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CSA System | Dako | K1500 | Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| Biotin anti-mouse IgG1 | BD | 553441 | |
| Mouse IgG1 K Isotype Control | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS(Tris-buffered saline), 10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs; Diluted to 1X with ddH2O for washes; |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST |
| Target Retrieval, 20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | Diluted to 1x with ddH2O |
| 190 Proof Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 Proof Ethyl Alcohol | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| Xylene | VWR | 95057-827 | |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Coverslips | Corning | 2940-245 | |
| Humidity chamber | Sigma | H6644 | |
| Table 1. Reagents and equipment. |
References
- Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
- Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
- Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
- Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
- Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
- Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
- Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
- Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
- Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
- Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
- Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
- Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
- Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
- Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
- Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
- Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
- Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
- Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
- Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
- Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
- Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37 (2012).
