인간의 췌장 Islets위한 염색법 프로토콜
Summary
이 비디오는 hematoxylin 및 eosin (H & E)과 immunohistochemistry (IHC)을 사용하여 인간의 췌장 islets의 특성화를위한 절차를 설명합니다. 머리, 몸, 그리고 꼬리 지역의 췌장 부분은 섬 내분비 성분 (인슐린, 글루카곤, 그리고 췌장 폴리펩티드), 세포 복제 (Ki67) 및 염증 infiltrates (H & E, 인 경우에는 3 번 CD)를 결정하기 위해 H & E와 IHC 모두가 묻은 게있다. uncinate 지역은 췌장 폴리펩티드에 대한 IHC를 사용하여 지역화된됩니다.
Abstract
섬 지역과 숫자, 성인 인간의 췌장의 내분비 세포 성분의 예측은 몇 십만에서 500에서 1,500 밀리그램 1-3으로 수백만 및 베타 질량 범위에 따라 다릅니다. 이 알려진 이질로 표준 처리 및 염색법 절차는 췌장 영역이 명확하게 정의되고 islets가 엄격한 조직 병리학 및 immunolocalization 시험을 사용하여 특징되었습니다 있도록 개발되었습니다.
장기 기증자에서 발견한 인간의 췌장을 처리를위한 표준화된 절차는이 시리즈의 파트 1에 설명되어 있습니다. 췌장은 가로 섹션 뒤에 세 주요 영역 (머리, 몸, 꼬리)로 처리됩니다. 췌장의 머리에서 가로축 부분이 더 나뉩니다 같은 크기에 따라 표시하고, 하위 섹션을 나타냅니다하기 가나다순으로 정리. 이러한 표준화가 이루어진 islets을 포함 uncinate 지역을 포함한 헤드 지역의 전체 교차 단면 분석을 위해 수주로 꼬리 지역에 췌장 폴리펩티드의 세포.
현재의 보고서는이 시리즈의 일부 2를 구성하고 섬 내분비 세포, 복제, 그리고 T 세포 infiltrates에 대한 강조와 함께 췌장 파라핀 섹션의 시리얼 sectioning 및 histopathological 특성화에 사용되는 절차를 설명합니다. 췌장 섹션의 병리는 두 exocrine, ductular 및 내분비 구성 요소를 특성화하기위한 것입니다. exocrine 구획은 특히 췌장 intraductal neoplasia 4의 존재에 대한 관계에서, pancreatitis의 존재 (활성 또는 만성), 위축증, 섬유증, 그리고 지방뿐만 아니라 덕트 시스템에 대해 계산됩니다. Islets은 형태, 크기, 밀도, 내분비 세포, 염증, 섬유증, 아밀로이드, 그리고 H & E와 IHC 얼룩을 사용하여 복제 또는 apoptotic 세포의 존재를 평가하고 있습니다.
파트 2에서 설명한 마지막 구성 요소는 스테인드 슬라이드의 제공입니다디지털 전체 슬라이드 이미지로의. 디지털 슬라이드는 가상 biobank를 만들어 온라인 병리 데이터베이스의 경우, 췌장 영역으로 구성됩니다. 이 온라인 컬렉션에 대한 액세스는 현재 제 1 형 당뇨병 연구에 관련된 200 개 이상의 임상의와 과학자에게 제공됩니다. 온라인 데이터베이스는 파라핀 또는 냉동 시리얼 섹션에 대한 블록을 선택하는 신속하고 완벽한 데이터 공유 및 수사를위한 수단을 제공합니다.
Protocol
Discussion
시간의 경과에 슬라이드 다수에 걸쳐 컴퓨터 기반 알고리즘을 사용하여 특히 때 IHC 절차의 표준화, 이미지 분석을 위해 중요합니다. 이 보고서에 설명된 IHC 염색법의 절차는 8 시간 노동 일 이내 autostainer를 사용하여 주어진 기증자의 샘플 배치 분석을 허용할 것이며, 이전의보고 5에서 수정됩니다. 각 스테인드 슬라이드 디지털 전체 슬라이드 이미지가 웹 기반의 온라인 병리 시스템을 통…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기증자의 가족과 전문가의 도움이 연구와 에밀리 몽고메리, 로버트 Pietras, 앤 푸, Mitali Agarwal, 그리고 Roshan Agarwal에 관련된 장기 조달 기관 감사드립니다. 이 작품은 당뇨병과 췌장 장기 기증자를위한 네트워크를 지원 소아 당뇨병 연구 재단 (MC-T.)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | FisherScientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | DAKO | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | FisherScientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | FisherScientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents.
| Primary Antibody | Host species | Vendor | Cat. # | Comments and Antigen Retrieval |
| Paraffin | ||||
| Amylase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrate |
| Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrate |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, cleaved | Rabbit | Cell Signaling | 9961 | Citrate or Trilogy |
| CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrate or Trilogy |
| CD3 | Rabbit | DAKO | A0452 | Citrate |
| CD34 | Mouse | Cell Signaling | 3569 | Citrate |
| CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrate |
| CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrate |
| CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrate |
| CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrate |
| Chromogranin A | Rabbit | DAKO | A0430 | Citrate |
| CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrate |
| CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrate |
| CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrate |
| C-peptide | Rabbit | Cell Signaling | 4593 | Citrate |
| Foxp3 | Rat | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrate |
| Ghrelin | Goat | Santa Cruz | SC-10386 | |
| Ghrelin | Rabbit | Abcam | ab85104 | |
| Glucagon | Rabbit | DAKO | A0565 | |
| Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrate |
| Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Citrate |
| Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogy |
| Glut-2 | Rabbit | Santa Cruz | SC-9117 | Not expressed in human islets |
| Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrate |
| Mafa | Rabbit | Novus Biological | NB400-137A | Trilogy |
| Pancreatic polypeptide | Rabbit | Invitrogen | 18-0043 | Citrate |
| Pdx-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrate or Trilogy |
| Proinsulin | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulin | Mouse | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Citrate |
| Secretagogin | Rabbit | Sigma | HPA 006641 | Citrate |
| Smooth muscle actin | Rabbit | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | Rabbit | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | Mouse | DAKO | M0776 | Citrate |
| Fresh Frozen | Host species | Vendor | Cat. # | Comments |
| CD11b | Rat | Abcam | ab6332 | Fix with 4% PF |
| CD11c | Rabbit | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Mouse | Novus Biological | NB 600-564 | Use overnight incubation for paraffin sections |
| CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fix with acetone |
| GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fix with 4% PF |
| HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fix with acetone or 4% PF |
Table 2. Primary antibodies.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica | H&E stains | |
| Premium Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | FisherScientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment.
References
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- Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
- Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
- Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
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