Picoeukaryote के जीनोमिक परिवर्तन<em> Ostreococcus tauri</em
Summary
इस आलेख की अनेक जीवकोष समुद्री alga की आनुवंशिक परिवर्तन का वर्णन<em> Ostreococcus tauri</em> Electroporation द्वारा. इस यूकेरियोटिक जीव उच्च संयंत्रों के लिए एक प्रभावी मॉडल मंच है, बहुत कम जीनोमिक और सेलुलर जटिलता possesing और आसानी से दोनों सेल संस्कृति और रासायनिक जीव विज्ञान के लिए उत्तरदायी जा रहा है.
Abstract
Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.
Protocol
Discussion
सेलुलर राज्य और संस्कृति axeny परिवर्तन की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है. हालांकि कोशिकाओं को आम तौर पर 12 प्रकाश घंटे के चक्र में रखा जाता है, 12 घंटे अंधेरे, इन परिस्थितियों में विकसित कोशिकाओं में परिवर्तन दक्षता के लिए अपर्याप्त होना पाया गया. दोहराया / pelleting मेजबान चरणों के दौरान, कोशिकाओं हमेशा आसानी से resuspend चाहिए. यदि कोशिकाओं, कुल, या बलगम की तरह पदार्थ मौजूद है, यह बेहतर है शुरू से ही प्रक्रिया फिर से शुरू. आमतौर पर, ~ 50 कालोनियों प्रत्येक परिवर्तन थाली पर उम्मीद की जा सकता है, नकारात्मक नियंत्रण प्लेट पर कोई भी बनाम. कम परिवर्तन दक्षता के मामले में, संवर्धन शर्तों कोशिकाओं इष्टतम राज्य में कर रहे हैं करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए अलग किया जाना चाहिए. चर कि परिवर्तन दक्षता प्रभावित प्रयोगशाला में परिवेश तापमान (20 डिग्री सेल्सियस के करीब होना चाहिए) और हैंडलिंग गति (कोशिकाओं वसूली के लिए [2.7] [2.3] pelleting से प्रक्रिया ~ 1 घंटा लेना चाहिए) शामिल हैं. यह भी महत्वपूर्ण है कि सभी एक समाधानफिर प्रत्येक परिवर्तन से पहले ताजा कर दिया. प्लेटों में शामिल करने के लिए, LMP से agarose की एकाग्रता महत्वपूर्ण है Ostreococcus कोशिकाओं. उच्च agarose सांद्रता में विकास नहीं होगा, और कम मात्रा में फैलाना होगा.
तीन Ostreococcus के लिए परिवर्तन वैक्टर पहले 6 प्रकाशित किया गया है, और अधिक वैक्टर को उत्पन्न करने और शीघ्र ही प्रकाशित की उम्मीद कर रहे हैं. मौजूदा वेक्टर 6 पॉट ल्यूक सी टर्मिनल जुगनू luciferase तेजी से ट्रांसजेनिक लाइन चयन प्लस विनयशील अभिव्यक्ति पैटर्न की अनुमति टैग के साथ संयोजन में पसंद का एक promotor के उपयोग की अनुमति देता है, के जबकि Potox 6 वेक्टर मजबूत inducible 13 Ostreococcus से लिया promotor किया जाता है उच्च आत्मीयता हित के जीन की overexpression के लिए फास्फेट ट्रांसपोर्टर जीन (HAPT). वेक्टर Potox ल्यूक Potox से प्राप्त है, एक अतिरिक्त luciferase मार्कर है कि overexpression लाइनों की अप्रत्यक्ष चयन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के पेट <s> ऊपर से 14. इन वैक्टर पर सफल चयन मार्करों Nourseothricin और G148 हैं. हालांकि, Ostreococcus कोशिकाओं अत्यधिक कई एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, और ट्रांसजेनिक Ostreococcus कोशिकाओं के चयन के लिए आवश्यक यौगिकों की सांद्रता पारंपरिक मॉडल प्रणाली (2 मिलीग्राम / एमएल) के लिए की तुलना में अधिक है.
हालांकि प्रक्रिया अक्षम प्रकट होता है, कोशिकाओं और प्लाज्मिड इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक डीएनए के बड़ी संख्या में कोई महत्वपूर्ण बाधा बन गया है. एक बड़ी सीमा यह है कि हर उत्पन्न लाइन कि चयन मार्कर के लिए प्रतिरोधी है के लिए व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया जा जाँच करने के लिए की जरूरत है कि पूरे निर्माण डीएनए में एकीकृत है. हम उदाहरण में जो चयन मार्कर के सफल अभिव्यक्ति ब्याज की वास्तविक जीन की प्रविष्टि के अनुरूप नहीं था मनाया, यानी आंशिक एकीकरण हो सकता है. जाहिर है, जीनोम में यादृच्छिक प्रविष्टि भी मतलब है कि वहाँ इस पद्धति का उपयोग करके प्रविष्टि साइट की कोई नियंत्रण नहीं है, और विधियों खमुताबिक़ पुनर्संयोजन पर ased वर्तमान में विकसित किया जा रहा है. हालांकि, विधि यहाँ वर्णित है, हमारी सबसे अच्छा ज्ञान के लिए, वर्तमान में केवल विशेषता के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित Ostreococcus कोशिकाओं को उत्पन्न विधि.
के रूप में Ostreococcus tauri हाल ही में एक प्रयोगात्मक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है, ज्यादातर इन कोशिकाओं के साथ काम करने के तरीके विकसित करने और बढ़ती अनुसंधान शामिल समुदाय द्वारा परिष्कृत की संभावना है. इस प्रोटोकॉल के लिए मदद लोग Ostreococcus साथ काम आरंभ करना है, लेकिन किसी भी तरह से सभी इस microalga के जीनोमिक परिवर्तन के बारे में पता है का वर्णन का दावा है. लेखकों विश्वास है कि पाठकों के इन्क्यूबेटरों में छोटे मतभेदों (प्रकाश के स्तर या गुणवत्ता) और अन्य मानकों मौजूद होगा के रूप में अपनी जरूरतों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल है और संभावना के लिए हर व्यक्ति प्रयोगशाला में अनुकूलित किया जाना है इस के लिए की जरूरत है स्वस्थ संस्कृतियों प्राप्त करने में सक्षम हो जाएगा प्रोटोकॉल. माहिर के बाद तकनीक यहाँ वर्णित है,वैक्टर luminescent, फ्लोरोसेंट, या प्रवर्तक की एक श्रृंखला के नियंत्रण के तहत अन्य टैग संलयन लाइनों उत्पन्न करने के लिए निर्माण किया जा सकता है. इस रोमांचक उपन्यास प्रयोगात्मक मंच अध्ययन कैसे जटिल जैव रासायनिक समस्याओं को कम जटिलता, जिसमें औषधीय दृष्टिकोण अत्यधिक 3 मदद की है की एक यूकेरियोट में हल कर रहे हैं के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
बीबीएसआरसी द्वारा वित्त पोषित और EPSRC D019621 पुरस्कार एकीकृत सिस्टम जीवविज्ञान के लिए केंद्र SynthSys. यूरोपीय संघ FP6 नेटवर्क उत्कृष्टता "समुद्री जीनोमिक्स" FYB करने के लिए अनुदान की आनुवंशिक परिवर्तन विधियों के विकास के वित्त पोषण किया है.
Materials
| Medium constituents | |||
| Chemical | Catalogue number | Supplier | |
| Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
| NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
| NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
| H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
| Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
| Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
| FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
| Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
| ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
| CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
| MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
| CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
| Biotin | 47868 | Sigma | |
| Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
| Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
| Neomycin | N6386 | Sigma | |
| Kanamycin | K4000 | Sigma | |
| Consumables for culturing | |||
| Item | Catalogue number | Supplier | |
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
| TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
| TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
| Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon | |
| Chemicals for transformation | ||
| Chemical | Catalogue number | Supplier |
| D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
| Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
| ClonNat | 51000 | Werner |
| Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
| Consumables for transformation | ||
| Item | Catalogue number | Supplier |
| Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
| Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
| Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
| Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
| Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
| Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
| Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
| Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |
References
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