Denne artikkelen beskriver genetisk transformasjon av encellet marine alger<em> Ostreococcus Tauri</em> Med electroporation. Dette eukaryot organisme er en effektiv modell plattform for høyere planter, possesing sterkt redusert genomisk og cellulær kompleksitet og være lett mottakelig for både cellekultur og kjemisk biologi.
Vanlige problemer som hindrer rask fremgang i Plant Sciences inkluderer mobilnettet, vev og hele organismen kompleksitet, og særlig det høye genomisk redundans påvirker enkle genetikk i høyere planter. Romanen modell organisme Ostreococcus Tauri er den minste frittlevende eukaryote kjent for å date, og besitter en sterkt redusert genom størrelse og cellulær kompleksitet 1,2, manifestert ved tilstedeværelsen av bare én av de fleste organeller (mitokondrie, kloroplast, Golgi stabel) per celle, og et genom inneholder bare ~~~HEAD=NNS 8000 gener. Videre gir kombinasjonen av unicellularity og enkel kultur en plattform mottagelig for kjemisk biologi tilnærminger. Nylig har Ostreococcus blitt ansatt for å studere grunnleggende mekanismene bak circadian tidtaking 3-6. Resultater fra denne modellen organismen har påvirket ikke bare plante vitenskap, men også hos pattedyr biologi 7. Dette eksemplet viser hvordan rask eksperimentering i enEnkelt eukaryote fra den grønne linjen kan akselerere forskning i mer komplekse organismer ved å generere testbare hypoteser som bruker metoder teknisk gjennomførbare bare i denne bakgrunnen av redusert kompleksitet. Kjennskap til ett genom og muligheten til å endre gener er viktige verktøy i enhver modell arter. Genomisk 1, 8 Transcriptomic, og proteomikk 9 for denne arten er fritt tilgjengelig, mens de tidligere rapporterte metoder 6,10 til genetisk forandre Ostreococcus er kjent for å få laboratorier over hele verden.
I denne artikkelen, til de eksperimentelle metoder genetisk transformere denne romanen modell organisme med en overexpression konstruere ved hjelp av electroporation er beskrevet i detalj, samt metode for inkludering av transformerte celler i lav prosentandel agarose å tillate valg av transformerte linjer som stammer fra en enkelt forvandlet celle. Etter den vellykkede anvendelse av Ostreococcus til døgnrytmen forskning, kan økende interesse Ostreococcus forventes fra ulike forskningsområder innenfor og utenfor anlegget fag, deriblant bioteknologiske områder. Forskere fra et bredt spekter av biologiske og medisinske fag som arbeider på bevarte biokjemiske mekanismer kan vurdere å forfølge forskning i Ostreococcus, fri fra genomisk og organismebiologi kompleksiteten større modell arter.
Cellular staten og kultur axeny er av avgjørende betydning for transformasjon prosedyren. Selv om cellene er vanligvis opprettholdt i sykluser på 12 timer lys, ble 12 timers mørke, transformasjon effektivitet i celler dyrket under disse forholdene viser seg å være utilstrekkelig. Under gjentatte pelletering / resuspensjon trinnene, skal cellene alltid resuspender lett. Hvis cellene samlet, eller en slim-lignende substans er til stede, er det bedre å starte prosedyren fra begynnelsen igjen. Vanligvis kan ~~~HEAD=NNS 50 kolonier kan forventes på hver transformasjon plate, kontra ingen på den negative kontrollen plate. Ved lav transformasjon effektivitet, bør dyrking forholdene endres for å sikre celler er i optimal tilstand. Variabler som påvirker transformasjon effektivitet inkluderer omgivelsestemperatur i laboratoriet (bør være nær 20 ° C) og håndtering hastighet (Procedure fra pelletering celler [2,3] til utvinning [2,7] skal ta ~ 1 time). Det er også viktig at alle løsninger enre laget fersk før hver transformasjon. For inkludering i plater, er konsentrasjonen av LMP agarose avgjørende. Ostreococcus cellene vil ikke vokse i høye konsentrasjoner agarose, og vil spre i lave konsentrasjoner.
Tre transformasjon vektorer for Ostreococcus har blitt publisert tidligere seks, og flere vektorer forventes å bli generert og publisert kort tid. Den eksisterende vektor Pot-Luc 6 tillater bruk av en promotor av valget i kombinasjon med en C-terminal ildflue luciferase tag tillate raskere transgen linjevalg pluss medgjørlig uttrykk mønstre, mens Potox vektoren 6 bærer sterke induserbar 13 promotor tatt fra Ostreococcus høy affinitet Fosfat Transporter (HAPT) genet for overuttrykte genet av interesse. Den Potox-Luc vektor kommer fra Potox, bærer en ekstra luciferase markør som kan brukes for indirekte valg av overuttrykk linjer <sopp> 14. Vellykkede markeringsindikatorene på disse vektorer er Nourseothricin og G148. Men Ostreococcus celler er svært motstandsdyktig mot mange antibiotika, og konsentrasjonene av forbindelser som er nødvendige for valg av transgene Ostreococcus celler er høyere enn for konvensjonelle modellen systemer (2 mg / ml).
Selv om prosessen synes ineffektive, utgjør det store antallet av celler og plasmid DNA som trengs for denne prosedyren ingen vesentlig hindring. En større begrensning er at hver generert linje som er resistent mot valgbar markør må analyseres individuelt for å sjekke at hele konstruksjonen er integrert i DNA. Vi har observert eksempler på at vellykket uttrykk for valgbar markør ikke svarer til innsetting av selve genet av interesse; dvs. delvise integrasjoner kan forekomme. Tydeligvis betyr tilfeldig innsetting i genomet også at det ikke er kontroll av innstikkstedet ved hjelp av denne metoden, og metoder bdessuten økt på homolog rekombinasjon er under utvikling. Men beskrev metoden her er, etter vår beste kunnskap, for tiden den eneste preget metode for å generere genmodifiserte Ostreococcus celler.
Som Ostreococcus Tauri har kun nylig blitt brukt som en eksperimentell modell organisme, er de fleste metoder som arbeider med disse cellene sannsynlig å utvikle seg og bli videreutviklet av den voksende forskningsmiljøet involvert. Denne protokollen er ment å hjelpe folk i gang arbeid med Ostreococcus, men på ingen måte påstår å beskrive alt som er å vite om genomisk transformasjon av denne microalga. Forfatterne har tillit til at leserne vil kunne tilpasse denne protokollen til sine egne behov som små forskjeller i kuvøser (lysnivåer eller kvalitet) og andre parametre vil eksistere og sannsynligvis må optimaliseres i hver enkelt laboratorium for å oppnå sunne kulturer trengs for denne protokoll. Etter å mestre teknikkene som beskrives her,vektorer kan være konstruert for å generere selvlysende, fluoriserende, eller andre merkede fusion linjer under kontroll av en rekke promotors. Denne spennende romanen eksperimentelle plattformen vil være nyttig å studere hvordan kompliserte biokjemiske problemer løses i en eukaryote av redusert kompleksitet, der farmakologiske tilnærminger er svært lettet tre.
The authors have nothing to disclose.
SynthSys et Senter for Integrative Systems Biology finansiert av BBSRC og EPSRC prisen D019621. EU FP6 Network of Excellence "Marine Genomics" tilskudd til FYB har finansiert utviklingen av genetiske transformasjon metoder.
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |