प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल के आधार पर¹⁵ एन मेटाबोलिक लेबलिंग, immunoprecipitation, मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आत्मीयता मॉडुलन

Summary

हम क्विक (मात्रात्मक पछाड़ना के साथ संयुक्त immunoprecipitation) दृष्टिकोण है कि पहले शुरू की गई थी सच्चे और झूठे प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के बीच भेद की एक बदलाव को प्रस्तुत करते हैं. हमारे दृष्टिकोण पर आधारित है^15N चयापचय लेबलिंग, एटीपी, immunoprecipitation, और मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री की उपस्थिति / अनुपस्थिति से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की समानताएं मॉडुलन.

Abstract

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available¹. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment². Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice³. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown⁴, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)⁵ and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate^5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.

Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for ¹⁵N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein⁷ (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state⁸. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE1⁹.

Protocol

1. एंटीबॉडी सोखना एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (फाल्कन) में एक Sepharose प्रोटीन की 120 मिलीग्राम वजन. 15 मिलीग्राम प्रोटीन के रूप में एक sepharose प्रत्येक immunoprecipitation (आईपी) के लिए की जरूरत है इस राशि 8 आईपी के लिए पर्याप्त है. 5 मिलीग्राम 0.1 एम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) जोड़ें और प्रोटीन 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक Sepharose प्रफुल्लित जाने (ध्यान दें कि इस बात से सभी चरणों के दस्ताने के साथ किया जाना चाहिए केरातिन और बर्फ पर प्रदूषण से बचने के लिए प्रोटीन गिरावट / जटिल हदबंदी से बचने.) 60 सेकंड के लिए 1000 XG और 4 ° गोली सी सूजन प्रोटीन एक Sepharose अपकेंद्रित्र. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और 5 मिलीग्राम 0.1 एम फॉस्फेट बफर (7.4 पीएच) में मोती resuspend. इस कदम को मोती अच्छी तरह से धोने के लिए तीन बार दोहराएँ. पिछले centrifugation कदम के बाद, तैरनेवाला हटाने और फॉस्फेट बफर के लगभग 0.5 मिलीग्राम छोड़ दें. 0.9 मिलीलीटर 0.5 एम फॉस्फेट (7.4 पीएच) बफर, 400 जोड़ेंμl आत्मीयता प्राथमिक एंटीबॉडी लक्ष्य (यहाँ HSP70B), प्रोटीन और एक नियंत्रण प्रोटीन (यहाँ CF1β) के खिलाफ 16 μl एंटीबॉडी के खिलाफ (आईपी प्रति 50 μl) शुद्ध. DDH 2 हे के साथ 5 मिलीग्राम की कुल मात्रा को भरें. (कि आत्मीयता शुद्ध एंटीबॉडी unspecific IgGs, जो नैनो LC-एमएस विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप द्वारा प्रदूषण को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए नोट. एक प्रोटोकॉल Willmund एट अल (2005) 10 देखने के CF1β एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में उपजी है और चुना गया क्योंकि यह प्रचुर मात्रा में है और सेल के बाद, घुलनशील और झिल्ली भागों में पेश वैकल्पिक रूप से, contaminating प्रोटीन के स्तर असमान लोड करने के लिए मानक के अनुसार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.) एक ट्यूब रोलर (कैट RM5W, rpm 36) पर 1 घंटा 25 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के दौरान सोखना IgGs Sepharose मोती प्रोटीन की अनुमति दें. 1000 XG और 4 ° गोली सी प्रोटीन एक Sepharose मोती में 60 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला और आर हटाने5 मिलीग्राम 0.1 एम सोडियम borate बफर (9.0 पीएच) में मोती esuspend. इस कदम के लिए अच्छी तरह से amines कि crosslinker बुझाना होगा को हटाने के लिए तीन बार दोहराएँ. 25.9 मिलीग्राम वजन ताजा, ठोस dimethylpimelimidate और यह 5 मिलीग्राम 0.1 एम सोडियम borate बफर (9.0 पीएच) में 20 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त resuspend. इस समाधान के एक प्रोटीन Sepharose मोती जोड़ें. IgGs पार से लिंक करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक ट्यूब रोलर पर एक प्रोटीन के लिए अनुमति दें. 1000 XG और 4 ° गोली सी मोती में 60 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और मोती में 5 मिलीग्राम 1 Tris एचसीएल एम (7.5 पीएच) मुफ्त crosslinker बुझाना resuspend. इस कदम को एक बार दोहराएँ और 25 पर 2 घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस या 12-24 घंटा 4 ° सी एक ट्यूब रोलर पर. वैकल्पिक: प्रोटीन अगर एक Sepharose IgGs के लिए मिलकर मोती सीधे एक सप्ताह तक के लिए भंडारण, आईपी के लिए नहीं इस्तेमाल कर रहे हैं संभव है. इसके लिए 1000 XG और 60 सेकंड के लिए 4 अपकेंद्रित्र ° C गोली के लिए मोती, ध्यान supern हटाने के5 मिलीग्राम 0.1 एम फॉस्फेट बफर में atant और resuspend मोती (7.5 पीएच) 4 में 0.02% सोडियम azide और दुकान युक्त ° C आगे उपयोग जब तक. 2. सेल, Crosslinking, और नमूना तैयार मध्यम में दो Chlamydomonas संस्कृतियों 7.5 मिमी युक्त बढ़ो 14 एनएच 4 सीएल या 15 NH नाइट्रोजन ~ x 10 6 कोशिकाओं / एमएल 5 के एक घनत्व के लिए स्रोत के रूप में 4 सीएल. कोशिकाओं को पूरी लेबलिंग के लिए कम से कम दस पीढ़ियों के माध्यम से पारित करने की जरूरत है. यहाँ, कोशिकाओं photomixotrophically नल 11 मध्यम में बड़े हो रहे थे सफेद रोशनी के साथ लगातार विकिरण (30 μE मीटर -2 एस -1) के तहत 25 में एक घूमनेवाला हिलनेवाला डिग्री सेल्सियस पर. चार जीएसए ट्यूब और फसल की कोशिकाओं के लिए 4000 XG और 4 ° (सेल प्रत्येक अशेष भाजक के लिए काटा संख्या सी लक्ष्य के सेलुलर एकाग्रता पर निर्भर करता है पर एक 4 मिनट centrifugation द्वारा दो 14 में से प्रत्येक aliquots एन और स्थानांतरण 15 एन लेबल कोशिकाओं प्रोटीन और ई निर्धारित किया जा की जरूरतmpirically अग्रिम में करने के लिए सुनिश्चित करें कि पर्याप्त प्रोटीन लक्ष्य उपजी है. एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु अशेष भाजक प्रति 10 9 कोशिकाओं, यानी, 5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के साथ एक संस्कृति के 200 मिलीलीटर है.) Crosslinking के लिए केवल: इस मामले में प्रोटीन परिसरों आईपी करने से पहले Crosslinked जाएगा, कोशिकाओं को मध्यम में वर्तमान amines को दूर धोया जा जरूरत है. इस के लिए, 40 मिलीलीटर पूर्व ठंडा KH बफर में resuspend कोशिकाओं (20 मिमी HEPES KOH (7.2 पीएच), 80 मिमी KCl) और उन्हें 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों को हस्तांतरण. 1000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र इस कदम को एक बार दोहराएँ. 2 मिलीलीटर lysis बफर में Resuspend कोशिकाओं (20 मिमी HEPES KOH (7.2 पीएच), 1 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी KCl, 154 मिमी NaCl) 4 पूर्व ठंडा डिग्री सेल्सियस और उन्हें 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों को हस्तांतरण. जीएसए नलियों में एक अतिरिक्त 1 मिलीग्राम lysis बफर प्रत्येक के साथ शेष कोशिकाओं को ले लीजिए. प्रत्येक अशेष भाजक 50 μl 25 x protease अवरोध और 12.5 μl 1 एम 2 MgCl (3.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता) जोड़ें. 150 जोड़ेंμl lysis बफर, 12.5 μl 1 एम एटीपी, 833 μl मिमी 270 creatine फॉस्फेट और एक के लिए 7 μl creatine 5 ग्राम / μl phosphokinase (अंतिम एकाग्रता 2.5 मिमी एटीपी, 45 मिमी creatine फॉस्फेट, और 7 छ / मिलीलीटर creatine phosphokinase) 14-एन 15 और एन लेबल कोशिकाओं (इन + एटीपी aliquots) युक्त aliquots. अन्य 14-एन 15 और एन लेबल कोशिकाओं (इन – एटीपी aliquots) युक्त aliquots के लिए 930 μl lysis बफर और 70 μl यू 1 / μl apyrase जोड़ें. एटीपी – व्यय करना और एटीपी परिपूर्ण राज्यों की स्थापना के लिए एक ट्यूब रोलर पर 25 पर 2 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए सेते हैं. यदि crosslinking कदम छोड़ दिया जाता है, lysis बफर के एक और 1 मिलीलीटर जोड़ने. Crosslinking के लिए केवल: इस मामले में जांच की प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत क्षणिक हैं यह सलाह दी जाती है के लिए उन्हें एक crosslinking कदम द्वारा कब्जा. इस के लिए, ई 500 μl 20 मिमी dithio – बीआईएस (propionate succinimidyl) (डीएसपी) DMSO में भंग (अंतिम एकाग्रता 2 मिमी) जोड़नेsonication से पहले सीधे ach ट्यूब. बर्फ पर चार बार 20 सेकंड Sonicate ठंडा करने के लिए 20 सेकंड के बीच में ब्रेक के साथ कोशिकाओं को तोड़ने के लिए. (हम उत्पादन में 75% और 60% का कर्तव्य चक्र के नियंत्रण में एक KE76 टिप के साथ Bandelin Sonoplus HD2070 उपयोग अन्य मशीनों / उपकरणों / सुझावों के लिए आवश्यक सेटिंग्स के लिए अग्रिम में निर्धारित किया जा पूरा सेल को सुनिश्चित करने के लिए spilling से बचने की जरूरत है. ) Crosslinking के लिए केवल 4 में 1 घंटा के लिए incubating ° एक ट्यूब रोलर पर सी द्वारा प्रोटीन परिसरों पार से लिंक करने के लिए अनुमति देते हैं. Crosslinking के बाद, 500 μl 1 एम ग्लाइसिन और सेते के साथ एक और 15 मिनट के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस पर मुफ्त crosslinker बुझाना ट्यूब रोलर पर प्रत्येक ट्यूब के पूरक है. SW41 तिवारी पतली दीवार ट्यूब (Beckman कल्टर आइटम: +३,४४,०५९) में चार 6 मिलीग्राम sucrose कुशन (20 मिमी (7.2 पीएच) HEPES KOH, 0.6 एम sucrose) तैयार है, ध्यान रखना पूरे ~ sucrose पर 5.5 सेल lysates मिलीलीटर (lysis बफर के साथ संतुलन) कुशन और 200.000 XG में 30 मिनट और 4 ° C एक SW41 तिवारी रोटो के लिए अपकेंद्रित्रआर. चार 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों (sucrose तकिया के कुछ हिस्सों को स्थानांतरित करने से बचने के लिए) में घुलनशील प्रोटीन परिसरों युक्त ढाल के शीर्ष स्थानांतरण, उनमें से प्रत्येक के लिए 0.5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 350 μl 10% X-100 ट्राइटन जोड़ने, ध्यान से मिश्रण और 7 मिलीलीटर की कुल मात्रा lysis बफर जोड़ने. (प्रत्येक घुलनशील सेल निकालने के ताजा 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (Eppendorf ट्यूब) और 70 दो μl x एसडीएस नमूना बफर (4% एसडीएस, 125 मिमी Tris एचसीएल (6.8 पीएच), 20% ग्लिसरॉल, 10 जोड़ 70 μl स्थानांतरण % 2 mercaptoethanol) एसडीएस पृष्ठ और immunoblot विश्लेषण के लिए प्रत्येक के लिए.) Sucrose कुशन त्यागें और 3 मिलीलीटर lysis बफर प्रत्येक में झिल्ली छर्रों resuspend. 2% की एक अंतिम एकाग्रता प्रत्येक 1 मिलीलीटर 10% X-100 ट्राइटन जोड़ें, छर्रों भंग बर्फ पर sonicate, और 5 मिलीग्राम की कुल मात्रा के lysis बफर जोड़ने. SW41 तिवारी पतली दीवार ट्यूबों में तैयार एक और चार 6 मिलीग्राम sucrose कुशन, 2.10 कदम से ~ 5 solubilized झिल्ली मिलीलीटर ध्यान रखना sucrose परकुशन, 200.000 XG और 4 ° C एक SW41 तिवारी रोटर में 30 मिनट के लिए और अपकेंद्रित्र. स्थानांतरण चार 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में झिल्ली प्रोटीन परिसरों युक्त ढाल के शीर्ष और 7 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा (स्थानांतरण प्रत्येक घुलनशील सेल निकालने के 70 μl. ताजा lysis बफर जोड़ने (2% X-100 ट्राइटन युक्त) Eppendorf ट्यूब और एसडीएस पृष्ठ और immunoblot विश्लेषण के लिए प्रत्येक के लिए 70 μl 2 x एसडीएस नमूना जोड़ने के.) 3. Immunoprecipitation गोली एक प्रोटीन Sepharose 1000 XG पर एक centrifugation 60 सेकंड और 4 से मिलकर एंटीबॉडी (1.8 कदम या 1.9 से) युक्त मोती डिग्री सेल्सियस, ध्यान से 4 मिलीलीटर lysis बफर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend मोतियों को हटा दें. Lysis बफर में मोती समभार बनाना इस कदम दो बार दोहराएँ. भरें lysis बफर के साथ 8 मिलीग्राम और आठ 15 मिलीलीटर फाल्कन एटीपी परिपूर्ण और एटीपी खलाना 14 से घुलनशील या झिल्ली प्रोटीन परिसरों युक्त ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए निलंबन की 1 मिलीलीटर हस्तांतरण </sऊपर> एन और 15 N-लेबल की कोशिकाओं (2.9 और 2.12 कदम से). 4 डिग्री सेल्सियस से कम 2 घंटे के लिए एक ट्यूब तलछट प्रोटीन परिसरों रोलर पर सेते हैं. गोली XG 1000 और 4 में एक 60 सेकंड centrifugation द्वारा मोती डिग्री सेल्सियस और supernatants त्यागें. मोतियों की चोटी पर तरल पदार्थ की एक छोटी मात्रा छोड़ हस्तांतरण की सुविधा. प्रत्येक बाज़ ट्यूब से 1.5 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (Eppendorf ट्यूब) मोती स्थानांतरण. फाल्कन ट्यूबों में शेष सभी मोती को इकट्ठा करने के लिए, एक और 0.8 मिलीग्राम lysis बफर प्रत्येक के लिए 0.1% ट्राइटन युक्त, भंवर धीरे, 1000 XG और 60 सेकंड के लिए 4 अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस और Eppendorf ट्यूबों अवशिष्ट मोतियों के साथ बफर हस्तांतरण. ट्यूब विनिमय प्लास्टिक की दीवारों को पालन प्रोटीन से contaminations को रोकने के लिए आवश्यक है. गोली 16,100 XG पर centrifugation 15-सेकंड और 4 से मोतियों डिग्री सेल्सियस, ध्यान से और 0.1% ट्राइटन युक्त 1.3 मिलीलीटर lysis बफर में supernatants resuspend मोती हटा दें. इस कदम lysis buf के साथ दो बार दोहराएँऔर युक्त Triton fer lysis बफर कमी ट्राइटन के साथ दो बार अच्छी तरह से मोती धोने के लिए. मोतियों की चोटी पर तरल पदार्थ की एक छोटी मात्रा छोड़ हस्तांतरण की सुविधा. फिर ताजा 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों को मोती का हस्तांतरण करने के लिए प्लास्टिक की दीवारों को पालन प्रोटीन को हटाने. 1 मिलीलीटर lysis बफर Triton कमी के साथ पुराने ट्यूब धो और ताजा ट्यूबों सभी अवशिष्ट मोती हस्तांतरण. 15 सेकंड के लिए 16,100 XG अपकेंद्रित्र और 4 ° सी, एक सामान्य विंदुक के साथ 1 supernatants दूर है, तो एक 50 μl हैमिल्टन सिरिंज के साथ किसी भी शेष तैरनेवाला पूरी तरह से हटा दें. 4. Nano-LC-MS/MS लिए नमूना तैयार प्रत्येक ट्यूब 100 μl हौसले से तैयार क्षालन बफर (8 एम यूरिया, 25 मिमी एनएच 4 3 HCO) जोड़ें, 100 μl क्षालन बफर का उपयोग करने के लिए 800 rpm पर हैमिल्टन सिरिंज और सेते चिपके मोती धो एक thermomixer में 10 मिनट के लिए और 65 डिग्री सेल्सियस, और 30 में एक और 20 मिनट के लिए ° (सी. एक बहुत अधिक संपूर्णबाध्य प्रोटीन के क्षालन क्षालन 2% एसडीएस और बाद में वर्षा के साथ 80% एसीटोन के साथ हासिल की है.) 16,100 XG और 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र एक 50 μl हैमिल्टन सिरिंज के साथ ताजा ट्यूबों supernatants स्थानांतरण. मोती 50 μl क्षालन बफर जोड़ें, 50 μl क्षालन बफर का उपयोग करने से हैमिल्टन सिरिंज से चिपके मोती धोने और ऊष्मायन और centrifugation 4.1 और 4.2 के चरणों को दोहराएँ, क्रमशः. संबंधित eluates तरणताल. (ताजा Eppendorf ट्यूब eluates की 30 μl स्थानांतरण, 30, 2 μl x एसडीएस नमूना एसडीएस पृष्ठ और immunoblot विश्लेषण के लिए प्रत्येक के लिए बफर जोड़ें.) जुडा eluted + /-एटीपी इलाज से precipitates, एन 14 और 15 N-लेबल के रूप में घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन: 120 μl 15 N / + एटीपी और 120 14 μl N / एटीपी 120 μl 14 N / + एटीपी और 120 15 μl N / एटीपी 120 μl 15 N / + एटीपी और 120 14 μl N / एटीपी <br /> 120 14 μl N / + एटीपी और 120 15 μl N / एटीपी 1.5 हौसले से 6.5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए चार संयोजनों में से प्रत्येक के लिए 1 एम डीटीटी तैयार डाइसल्फ़ाइड बांड (crosslinker में उन सहित) को कम करने के लिए और 25 पर 30 मिनट के लिए सेते हैं μl ° सी. जोड़ें 10.5 हौसले से 25 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता कम thiols carboxymethylate और 25 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं 0.6 एम iodoacetamide तैयार μl जोड़ें. 256 μl 40 मिमी एनएच 4 3 HCO और 4 μl Lys – सी (0.1 ग्राम / μl), parafilm साथ मुहर ट्यूब, और 37 में कम से कम 16 एक रोटेशन पहिया पर रातोंरात घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस जोड़ें एक रोटेशन पहिया पर 470 μl 20 मिमी एनएच 4 3 HCO, 10 μl 100% (1% की एक अंतिम एकाग्रता) acetonitrile और 8 μl trypsin मोती, और 37 में कम से कम 16 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस 16,100 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस, और हस्तांतरण supernatants के लिए नए सिरे से 2 मिलीलीटर Eppendorf टब के लिए अपकेंद्रित्रतों. 50 μl 20 मिमी एनएच 4 3 HCO, 0.5% एसिटिक एसिड, और 1 supernatants साथ पूल के साथ पुराने ट्यूब धोयें. में desalting के लिए तैयार करते हैं, एक सिरिंज सुई के साथ Empore सी सामग्री 18 से बाहर दो डिस्क में कटौती और उन्हें एक 200-μl विंदुक टिप में रखकर द्वारा सी 18-StageTips घर का बना. इस तरह चार 200 μl सुझावों तैयार करते हैं. चार 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब और डालने के सुझावों के lids में पंच छेद. पूर्वशर्त सी बी 50 μl समाधान के साथ 18 StageTips (80% acetonitrile, 0.5% एसिटिक एसिड). 800 जी में 3 मिनट और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र 100 μl समाधान (0.5% एसिटिक एसिड, acetonitrile 2%) के साथ सी 18-StageTips संतुलन में लाना. 800 जी में 3 मिनट और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र इस कदम को एक बार दोहराएँ. सी 18-StageTips और अपकेंद्रित्र के पर tryptic digestions (4.9) से 800 जी में 3 मिनट और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए supernatants के 100 μl लोड इस चरण को दोहराएँ जब तक पूरा supernatants करने के लिए लागू किया गयास्तंभ. 3 मिनट के लिए 100 μl समाधान ए अपकेंद्रित्र के साथ 800 ग्राम और 25 डिग्री सेल्सियस पर सी 18-StageTips धो इस कदम को दो बार दोहराएँ. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में 800 जी में 3 मिनट और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए 50 μl समाधान बी अपकेंद्रित्र साथ tryptic पेप्टाइड्स Elute इस कदम को एक बार दोहराएँ. एक Vac गति में पूरा करने के लिए सूखी पेप्टाइड्स. वैकल्पिक: सील Eppendorf ट्यूबों parafilm और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस के साथ आगे उपयोग तक. 20 μl समाधान के साथ सूखे पेप्टाइड्स Resuspend एक और बर्फ पर कम से कम 1 घंटा, दो एक sonicator स्नान में 15 मिनट incubations द्वारा बाधित के लिए सेते हैं. 16,100 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला nano-LC-MS/MS के लिए लागू होते हैं. 5. प्रतिनिधि परिणाम N-14 लेबल चित्रा 2A में सेल के अर्क के लिए exemplarily दिखाया, HSP70B और CGE1 लगभग विशेष रूप से घुलनशील अंश, एटीपी राज्य के स्वतंत्र स्थानीयकृत हैं. मेंविपरीत CF1β घुलनशील और झिल्ली समृद्ध भिन्न करने के लिए स्थानीय है, sonication के रूप में झिल्ली स्थित CF ओ से इसे का हिस्सा कैंची, और इसलिए दोनों भागों के लिए नियंत्रण लोड के रूप में कार्य करता है. चित्रा 2B में दिखाया गया है, HSP70B की समान मात्रा विरोधी HSP70B एंटीबॉडी के साथ 14-N और 15 N-लेबल घुलनशील अर्क, एटीपी राज्य के स्वतंत्र से उपजी थे. इसके विपरीत, केवल थोड़ा HSP70B झिल्ली भागों से थोड़ा बड़ा मात्रा एटीपी समाप्त झिल्ली भागों से उत्पन्न रूप में एटीपी परिपूर्ण भिन्न करने के लिए तुलना के साथ उपजी किया गया था, इसलिए पहले परिणाम 9 corroborating. नहीं CGE1 एटीपी परिपूर्ण घुलनशील या झिल्ली भागों में HSP70B साथ सह उपजी, CGE1 की बड़ी मात्रा में थे, जबकि एटीपी समाप्त घुलनशील भागों से HSP70B साथ सह उपजी है, और थोड़ा एटीपी समाप्त झिल्ली भागों से. ADP राज्य में केवल HSP70B साथ CGE1 की बातचीत में भी मनाया जाता हैएमएस विश्लेषण: चित्रा 3, प्रतिनिधि HSP70B MS1 स्पेक्ट्रा और precipitates से CGE1 पेप्टाइड्स घुलनशील सेल के अर्क से HSP70B सीरमरोधी साथ उत्पन्न में दिखाए जाते हैं. चित्रा 3A में दिखाया प्रयोग में precipitates, 14 एन लेबल एटीपी और 15 एन – एटीपी युक्त अर्क लेबल कमी के अर्क के मिश्रण से थे. जबकि भारी और प्रकाश HSP70B पेप्टाइड लेबल प्रपत्र बराबर तीव्रता में पाया गया है, केवल CGE1 पेप्टाइड प्रकाश लेबल फार्म (निष्कर्षों से एटीपी) पाया गया था. चित्रा 3B में विरोधी HSP70B आपस में लेबल घुलनशील सेल के अर्क के मिश्रण से प्राप्त तलछट से ही पेप्टाइड्स दिखाए जाते हैं. तदनुसार, इस समय केवल भारी CGE1 पेप्टाइड (निष्कर्षों से एटीपी) के लेबल के फार्म का पता लगाया गया था, जबकि इस बार फिर दोनों, प्रकाश और भारी लेबल HSP70B पेप्टाइड्स के लिए मामला था. <strong> चित्रा 1. प्रायोगिक कार्यप्रवाह कोशिकाओं. Metabolically 14 और एन 15 एन के साथ कम से कम 10 पीढ़ियों के लिए नामांकित किया गया है और खेती के साथ आपूर्ति या एटीपी से समाप्त. सेल प्रोटीन परिसरों के बाद वैकल्पिक डीएसपी के साथ (एक्स – लिंक) Crosslinked सकता है. Lysed कोशिकाओं तो घुलनशील में अलग हो रहे हैं (एसओएल) और झिल्ली समृद्ध भिन्न (PEL). लक्ष्य (यहाँ HSP70B) प्रोटीन और प्रोटीन एक नियंत्रण (यहाँ CF1β) विशिष्ट एक sepharose मनकों (काला) प्रोटीन युग्मित एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitated हैं. धोने के बाद उपजी प्रोटीन और eluted immunoblotting द्वारा या तो सीधे विश्लेषण, या संबंधित 14-N और 15 + एटीपी और एटीपी राज्यों जमा कर रहे हैं, पचा और nano-LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण किया. में भिन्न एन लेबल उदाहरण के मामले में यहाँ दिखाया N-15 लेबल अंश एटीपी से समाप्त हो गया था. नियंत्रण प्रोटीन से तदनुसार, भारी लेबल (काले रंग) की तीव्रता के अनुपात करने के लिए प्रकाश लेबल पेप्टाइड्स (हल्के रंग)(CF1β), लक्ष्य (HSP70B) प्रोटीन और गैर विशेष रूप से बाध्य contaminants के आसपास हो सकता है, जबकि इस अनुपात के लिए विशेष रूप से लक्ष्य प्रोटीन (CGE1) के साथ बातचीत के लिए प्रोटीन बहुत अधिक होने की उम्मीद है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा 2. HSP70B immunoprecipitation के लिए इनपुट के एक विश्लेषण कुल प्रोटीन. (एसओएल) घुलनशील और झिल्ली (PEL) समृद्ध एटीपी (एटीपी) से या तो समाप्त या एटीपी और एक एटीपी regenerating प्रणाली (एटीपी +) के साथ पूरक भागों से निकाला गया था. प्रोटीन के अर्क के 0.01% एक 10% एसडीएस polyacrylamide जेल पर अलग हो गए थे, और और CGE1 HSP70B लोड को नियंत्रित करने CF1β सापेक्ष प्रोटीन के स्तर immunoblotting द्वारा विश्लेषण किया गया immunoprecipitates बी विश्लेषण. HSP70B 14 से immunoprecipitated एन और15 घुलनशील एन लेबल और झिल्ली सेल समृद्ध युक्त अर्क या एटीपी कमी. 3.3 immunoprecipitates की% करने के लिए इसी प्रोटीन 10% एसडीएस polyacrylamide जेल और HSP70B के स्तर और लोड हो रहा है नियंत्रण CF1β immunoblotting द्वारा विश्लेषण किया गया CGE1 रिश्तेदार पर अलग हो गए थे. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा 3. के एक प्रतिनिधि जन HSP70B स्पेक्ट्रा और विरोधी HSP70B से CGE1 पेप्टाइड्स मिश्रित घुलनशील fractions (N-14 एटीपी / 15 एन एटीपी +) पर प्रदर्शन immunoprecipitates + 14 और एन 15 एन लेबल पेप्टाइड्स, एटीपी के लिए इसी और पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रा. एटीपी राज्यों, क्रमशः HSP70B और सह immunoprecipitated CGE1 से दिखाए जाते हैं. दोनों पेप्टाइड्स triply चार्ज किया जाता है, HSP70B पेप्टाइड 22 नाइट्रोजन परमाणुओं, CGE1 पेप्टाइड्सआईडीई 19, 7.33 के एक बड़े पैमाने पर बदलाव और 6.33 मी / z, क्रमशः पारस्परिक प्रयोग (14 + N एटीपी / 15 एन एटीपी) से बी. प्रतिनिधि जन स्पेक्ट्रा इसी. एक ही एन 14 और 15 एन लेबल पेप्टाइड्स, यहाँ + एटीपी और एटीपी राज्यों, क्रमशः HSP70B और सह immunoprecipitated CGE1 से, इसी के पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रा दिखाया गया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

क्षणिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (क्विक-X) पर कब्जा करने के लिए एक crosslinking कदम है, और एक नियंत्रण के लिए असमान वर्षण की संभावना क्षमता ^{6 के} लिए मानक के अनुसार वर्षण की संभावना: हम जल्दी दृष्टिकोण करने के लिए हाल ही में दो सुधार शुरू की है. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल जल्दी दो और अधिक सुधार युक्त उपस्थित: पहला, हम ¹⁵ एन चयापचय लेबलिंग के लिए ⁵ SILAC की जगह. लाभ कर रहे हैं कि ¹⁵ एन चयापचय लेबलिंग बहुत SILAC की तुलना में सस्ता है, अगर ¹⁵ N सरल अकार्बनिक नमक के रूप में प्रदान की जाती है. इसके अलावा, ¹⁵ एन चयापचय के साथ क्विक लेबलिंग जीवों prototrophic सभी एमिनो एसिड के लिए लागू किया जा सकता है सबसे अधिक पौधों, कवक, और बैक्टीरिया जैसे. और अंत में ^5,6 SILAC निहित, arginine करने प्रोलाइन interconversion ¹⁵ एन लेबल पेप्टाइड्स की मात्रा का ठहराव के लिए एक समस्या नहीं मौजूद नहीं है. ¹⁵ एन प्रोटिओमिक्स डेटा के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए उपयुक्त उपकरणों के लिए उदाहरण ¹² MSQUANT मैं या¹³ OMIQS.

दूसरा, हम विशेष रूप से एक नमूने में दिए गए लक्ष्य प्रोटीन के साथ एक अन्य बनाम बातचीत प्रोटीन की मात्रा को कम करने के लिए एक साधन के रूप में आत्मीयता मॉडुलन परिचय. इस दृष्टिकोण का लाभ कर रहे हैं कि यह पछाड़ना म्यूटेंट, जो कुछ मॉडल प्रणाली के लिए उत्पन्न करने के लिए मुश्किल हैं या सभी में आवश्यक प्रोटीन लक्ष्य के मामले में उत्पन्न नहीं कर सकते हैं के निर्माण circumvents. इसके अलावा, यह संभवतः एक लक्ष्य प्रोटीन नीचे दस्तक करने के लिए सेल की एक प्रतिक्रिया के रूप में होने वाली अंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति की वजह से गलत व्याख्याओं से बचा जाता है: अगर अन्य प्रोटीन नीचे विनियमित के रूप में अच्छी तरह से कर रहे हैं और immunoprecipitation के लिए इस्तेमाल किया सीरमरोधी साथ पार प्रतिक्रिया, वे व्याख्या की जा होगा लक्ष्य प्रोटीन की सही बातचीत भागीदार के रूप में. पिछले, आत्मीयता मॉडुलन एक उचित अनुपात एंटीबॉडी प्रतिजन खोजने की जरूरत abolishes.

हालांकि हम मॉडल जीव के रूप में Chlamydomonas reinhardtii हमारे प्रोटोकॉल लागू, यह आसानी से किसी भी अन्य जीव है कि सेल संस्कृति में उगाया जा सकता है और नाइट्रोजन के स्रोत के रूप में अमोनियम या नाइट्रेट का उपयोग करने में सक्षम है के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. आत्मीयता मॉडुलन प्रोटीन परिसरों का एटीपी / ADP द्वारा सीधे अन्य संरक्षिकाओं substrates और काउहोट प्रोटीन के साथ बातचीत जिसका एटीपी राज्य पर निर्भर करता है के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे GroEL/HSP60/Cpn60 या HSP90 निगरानी प्रणालियों ^14,15, या किसी अन्य व्यवस्था करने के लिए जहां बाध्यकारी समानताएं एटीपी द्वारा संग्राहक हैं. आत्मीयता मॉडुलन मामलों में जहां प्रोटीन बातचीत के बीच समानताएं radicicol या geldanamycin तरह विशिष्ट, HSP90 ¹⁵ सिस्टम के मामले में दवाओं से बदल रहे हैं के लिए भी काम करना चाहिए.

हमारे प्रोटोकॉल का एक स्पष्ट सीमा है कि यह आवश्यकता आत्मीयता शुद्ध एक लक्ष्य एक विशिष्ट उपचार / दवा है कि साथी प्रोटीन के लिए अपने संबंध modulates प्रति संवेदनशील होने के लिए जाना जाता प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी. इसलिए, यह कोई उच्च throughput विधि है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
ProteinA Sepharose	Sigma-Aldrich	P3391
DMP (Dimethyl pimelimidate)	Sigma-Aldrich	D8388	Store desiccated at -20 °C, dissolve directly before use
Protease inhibitor (complete, EDTA-free)	Roche Applied Science	11873580001
ATP (Adenosin-5′-triphosphat)	Carl Roth	K054
Creatine phosphate	Sigma-Aldrich	27920
Creatine phosphokinase	Sigma-Aldrich	C7886
DSP Dithiobis [succinimidyl propionate]	Thermo Sientific	22585	Store desiccated at 4 °C
15NH4Cl	Cambridge isotope laboratories, Andover, MA	NLM-467
Lys-C (Endoproteinase Lys-C)	Roche Applied Science	11047825001
Trypsin beads (Poroszyme Immobilized Trypsin)	Applied Biosystems	2-3127-00	Mix vigorously directly before use
Empore C18 47 mm Disk	Varian	12145004