우리는 누드 마우스 및 이후 일련의 뇌에 인간 glioblastoma multiforme의 세포의 정확한, stereotactic 주입을위한 통합 방법을 설명 생체 내 이미징의 성장과 결과 xenografts의 치료에 대한 반응을 모니터링합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Glioblastoma multiforme의 (GBM)은 수술 절제술, 수술 방사선 요법 및 화학 요법 temozolomide 하나를 구성하는 표준 트라이 양상 치료에도 불구하고 인간 만 14.6 개월 평균 생존과 고급 차 뇌 암입니다. 새로운 치료 방법이 명확하게 삶의 환자의 생존과 품질을 개선하기 위해 필요합니다. 보다 효과적인 치료 전략의 개발은 인간의 질병을 요점을 되풀이 아직 종양의 성장과 치료 반응을 모니터링하기 위해 일련의 이미지를 허용 GBM의 동물 모델에 의해 도왔됩니다. 이 논문에서, 우리는 GBM 2의 주요 임상 기능을 요점을 되풀이 종양 xenografts의 결과로 누드 마우스의 뇌에 생체 이미지 형성 GBM 암 세포의 정확한 stereotactic 주입을위한 우리의 기술을 설명합니다. 이 방법은 재현 아르 종양을 산출하고 순차적 내부를 모니터링하는 생체 발광 생물 이미징에서 허용하는 동시에 정확한 해부학 위치에 자리 잡고 있습니다두개골 이종 이식의 성장과 치료 3-5에 대응. 이 방법은 낮은 perioperative 병적 상태와 사망률과 동물하여 잘 용납입니다.
프로토콜
A. 사전 수술 종양 세포 준비
- lentiviral 발현 벡터 (pGreenFire, 시스템 Biosciences)와 Transduce U251 glioblastoma multiforme의 전지는 안정적 반딧불의 루시 페라 제 유전자를 표현합니다.
- 이러한 세포 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과에 잠복기가 T75 조직 배양 플라스크에 1퍼센트 불필요한 아미노산을 보충 DMEM으로 구성 이글 배지 (DMEM)의 전체 Dulbecco의 수정의 10 ML에서 재배 된 5% C0 2, 37 ° C.
- 표준 세포 배양을 수행 인산염으로 세포를 세척으로 시작하는 생리 (PBS)는 trypsinizing 다음 버퍼.
- 전체 DMEM으로 트립신을 해소, 50 ML 원뿔 플라스크에 솔루션을 전송하고 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 카운터를 사용하여 세포 농도를 결정한다.
- 분당 약 3,000 회전에서 3 분에 완료 DMEM에서 수확 한 세포를 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 중 대기음50 ML 원뿔 플라스크의 하단에있는 세포 만 펠렛을 떠날 F 미디어.
- 신선한 완료 DMEM의 볼륨에서 셀을 다시 일시 중지 50,000 세포 / μl과 얼음에 위치 2 ML 멸균 유리 병에 송금 원하는 농도를 달성하기 위해, 나가 건조에서 세포를 방지하기 위해 신속하게 작업.
- 얼음에 세포가 간략하게 낮은 설정 세포 부착을 방지하기 위해 모든 ~ 20 분에 vortexed해야합니다. 세포는 안전하게 얼음에 게재 한 후 두 시간 intracranial 주입에 사용하실 수 있습니다.
B. Orthotopic 이종 이식 주입
- 기준, 사전 주입 중량을 수립 누드 athymic NCR 마우스 (뉴 / 뉴)를 무게. 우리는 보통 17 24g 사이의 무게와 마우스에게 시대의 6~10주을 선택합니다.
- 주입하기 전에 1 시간은 수술 통증과 염증에 대한 치료로 피하 주입을 통해 비 steroidal 항 염증성 약물 meloxicam의 5 밀리그램 / kg으로 마우스를 사전 ...에 의료를 베풀다.
- Anesthetiz전자 140 MG / kg 각각 10 밀리그램 / kg의 복용량에서 xylazine / 케타민 혼합물의 intraperitoneal 주사와 동물.
- 마우스가 발가락 핀치에 동물의 자발적인 응답을 평가하여 충분히 anesthetized인지 확인합니다. 동물이 냄새가 핀치에 응답하면 마취을 적용하거나 추가 마취 (원본 금액의 <25 %) 주입 고려 할 수있을 때까지 그 과정을 지연.
- 코의 restrainer의 물린 바에서 마우스의 앞니 치아에 훅을 넣었하고 마우스의 머리가 있다는 확보하면서 코를 통해 코 클램프를 강화하여 그냥 마우스 Stereotactic 플랫폼 (Stoelting 주식회사)에 대한 Stoelting 디지털에 위치에 대한 anesthetized 마우스를 준비 레벨 비행기.
- 귀 막대의 도움말 귀 운하의 꼬리 끝 부분에 있습니다 있도록 동물의 위치를 조정 Stoelting stereotactic 플랫폼에 절제된 마우스를 전송합니다. 동물의 두개골 - 투 - 꼬리 위치는 adjus되면테드, stereotactic 프레임에 물린 줄을 고정하십시오. 마우스가 수술하는 동안 피드백 제어 온도 규정을 제공 할 수있는 Stoelting 플랫폼에 테이프로 고정 확고한 플라스틱 가열 플레이트 (하버드 장치)에 휴식을해야합니다.
- 필요에 따라 귀 바의 높이를 조정 한 후 귀 운하의 꼬리 부분에 귀 바을 향상 마우스의 머리가 레벨 비행기에 있으며 손가락 터치에 고정되도록을 확보. 귀 바의 위치 후 호흡 곤란의 증상에 대해주의 깊게 모니터링합니다. 풀어 동물이 고통에있는 경우 재 위치.
- 동안 동물의 온도를 모니터링하기 위해 36에서 동물의 체온을 유지하기 위해 마우스 아래에 위치 가열 판에 피드백 제어를 제공하는 TCAT - 2DF 온도 컨트롤러 (하버드 장치)에 연결 직장 온도 프로브의 윤활 팁 ° C를 삽입 절차.
- preve에 눈 안과 연고를 적용NT는 건조.
- 눈을 피하기 위해 관리하고, 절개 사이트를 소독 할 수있는 마우스의 머리 위로 betadine 솔루션을 적용합니다.
- 마우스가 추가 케타민 / xylazine (초기 복용량의 <25 %) 필요한 경우 소량의 제공, 의식이 확인 발가락 핀치을 수행합니다.
- 0.45 mm 버 드릴 비트 (Stoelting) 알코올 패드를 사용하여 드릴 (Foredom Microdrill)에 부착 한 후에 만 드릴 비트를 immersing 15 초에 유리 구슬 살균기 (Germinator 500, CellPoint 과학)에 드릴 비트를 소독을 깨끗이 살균기의 구슬.
- 멸균 메스를 사용 caudally 눈의 수준에서 연장 중반 두피에 길이 방향으로 0.75 cm의 절개를합니다. bregma의 시각화를 확인합니다.
- Stoelting 플랫폼에 드릴 홀더를 첨부하여 드릴 홀더에서 0.45 mm 버 드릴 비트 (Stoelting)와 훈련 (Foredom Microdrill)를 배치, 위치에 고정.
- 정확히 t 이상 드릴 비트를 삽입그는 bregma하고 제로 아웃 z는 디지털 stereotactic 디스플레이의 좌표 X, Y,. 만 뼈를 피어싱, 위치 뒤쪽 2mm와 Foredom 훈련과 동물의 두개골에 오른쪽 대뇌 반구와 드릴의 bregma에 측면 1.5 mm의 드릴의 끝을 이동합니다. 멸균 면봉을 부드럽게 두개골의 시각화를 촉진하기 절개의 가장자리를 철회 할 수 있습니다.
- stereotactic 플랫폼에서 드릴과 드릴 홀더를 제거합니다.
- stereotactic 플랫폼에 Nanomite 주입기 주사기 펌프 (하버드 장치)를 연결합니다.
- 얼음에서 세포를 제거하고 부드럽게 간단한 펄스와 종양 세포를 포함하는 유리 병 또는 셀을 다시 일시 중지 할 수있는 병을 버려야지 중 부드럽게 소용돌이. 10 μl 주사기 (해밀턴 주사기)에 첨부 된 30 게이지 1 "긴 평면 베벨 바늘을 통해 세포 현탁액 7 μl를 그립니다. 주사기에서 큰 기포를 사용하지 마십시오. 유체의 초기 6 μl에 기포가 없는지 확인 어ich는 마우스에 주입 전체 볼륨 될 것입니다. 나머지 1 μl의 작은 기포가 신경 쓸 일이 아냐 수 있습니다. 세포에 손상을 최소화하기 위해 가능하면 세포 현탁액의 반복 추첨 업을 피하십시오.
- 주사기 주입기에로드 된 주사기를 배치합니다. 알코올 패드를 사용하여 extracranial 공간에서 성장하는 종양이 발생할 수 있습니다 암 세포와 절개 사이트의 오염을 방지하기 위해 바늘의 끝에서 나타나는 세포 현탁액의 유체 중 하나를 제거합니다.
- 0.5 μl / 분의 속도로 6.0 μl를 제공하기 위해 연료 분사 펌프를 설정합니다. 주입 한 후 주사기에 남아 세포 현탁액의 1 μl 자주 주사기에 수집 된 기포가 동물에 주입되지 않도록 보장합니다. 기포의 주입은 치명적인 공기 색전증이 발생할 수 있습니다.
- 두개골에 바늘 직각 (90도)를 유지 버 구멍에 주사기 바늘을 부활 시켰습니다. 바늘은 coordin 밖으로 두개골, 영 통과되면이 2.5 mm의 깊이에 도달 할 때까지 stereotactic 디지털 디스플레이 및 ates는 천천히 4 분의 기간 동안 바늘의 끝을 부활 시켰습니다. 바늘은 뒤쪽 해마의 피질과 영역을 통해 전달됩니다. X, Y, Z는 stereotactic 주입에 대한 좌표 등의 시상하므로 종양 세포와 중추 신경계을 퍼 뜨리고 가능성을 감소 심실에 근접 등의 중요한 뇌 구조에 부상을 피하는 동안 대뇌 반구 내에 측면 위치 종양을 생성하기 위해 선정되었습니다 바람직하지 않은 척추 종양을 야기 할 수도있다. bregma에 비해 뒤쪽 위치가 궤도에 ulcerating 대형 로컬 고급 종양의 가능성을 줄이기 위해 선정되었다. 그런 다음 2 분에 대해 깊이에서 바늘로 일시 정지하고 세포의 주입을 시작합니다.
- 주입하는 동안, 동안 버 구멍에서 빠져 refluxed 수 있습니다 모든 종양이 함유 유체를 제거하는 microsurgical의 스폰지 창을 반복적으로 두개골을 건조주입. microsurgical 스폰지로 바늘을 방해하지 마십시오. 이 액체를 제거하면 extracranial 공간에서 성장하는 종양의 가능성을 줄일 수 있습니다.
- 사출이 완료되면 약 2 분 동안 뇌에 바늘을두고 천천히 3-4 분에 걸쳐 바늘을 철회 할 수 있습니다.
- 귀 바, 주둥이의 restrainer를 풀어 stereotactic 장치에서 마우스를 제거합니다.
- 멸균 뼈 왁스로 머리에 버 구멍을 닫고는 살균면 - 날붙이 작은 주걱의 목조 끝에서 버 홀에서 앞뒤로 왁스를 문질러에 의해 증착. 구멍이 완전히 봉쇄하고 버 구멍을 밀폐 뼈 왁스가 인접 두개골과 수세식입니다 때까지 뼈 왁스를 적용 계속.
- 다시 대략 멸균 면봉으로 절개의 가장자리와 동물의 눈에 접착제 노출을 피하기 위해 관리하고, 상처를 밀봉하기 위해 동물 조직 접착제를 적용합니다.
- 마지막으로, 37로 설정 가열 패드에 마우스를 °동물까지 C는 의식을 복구합니다. 마우스 알림 및 응답되면 원래 케이지로 동물을 전송합니다.
C. 발광 생물 이미징 (BLI)는 종양 성장과 치료에 대한 응답을 모니터링 할
간략한 지침 발광 생물 이미징에 따르십시오.
- 이전 2퍼센트 isoflurane과 산소와 챔버에 종양을 이식 생쥐를 마취.
- 쥐가 anesthetized 있지만, 50 MG / ML의 농도로 PBS에 희석 D-luciferin의 칼륨 소금의 60 μl로 피하 또는 intraperitoneally 하나를 주입.
- 발광 생물 이미징 스캐너에서 코 콘에 마취의 흐름을 켜고 빠르게 코 콘에서 자신의 코를 게재하는 스캐너로 쥐를 전송합니다.
- 훨씬 낮은 신호 인접한 종양에 높은 신호 강도와 종양의 발광 생물 신호의 출혈을 제한 할 쥐 사이의 검은 색 디바이더를 배치합니다.
- 사용생활 이미지 소프트웨어, D-luciferin의 주입의 시간 후 30 분까지 총 기간 동안 자주 직렬 노출을. 우리는 이하 이상 노출 이미지의 가능성을 제한하는 "자동"으로 노출 시간을 설정 선호. 단일 노출> 5 분 할 수 없습니다.
- 적절한 간격으로 발광 생물 이미징를 반복 수행합니다. 시리얼 주간 영상 치료에 대한 응답을 테스트 많은 종 실험에 대한 합리적인 방법입니다.
- 이미지의 취득 후, 발광 생물 이미징 세션 중에 취득한 각 이미지에있는 각 종양 주변 관심 (ROI)의 영역을 그림으로써 종양을 분석 생활 이미지 소프트웨어 프로그램을 사용합니다. 배경 발광 생물 신호 강도의 정도에 따라 종양의 발광 생물 신호를 해결하기위한 관심 배경 영역으로 각 이미지의 각 마우스의 하단 측면에 관심 두 번째, 작은 지역을 적용합니다. 우리는 '래디언스'설정보다는 출력으로 "계산"을 사용 선호발광 생물 신호에 대한 값.
- Excel로 투자 수익 (ROI) 결과를 수출하고 각 마우스의 최대 배경 - 조정 발광 생물 신호를 결정합니다.
- 종양 성장의 시리얼 모니터링 표시된대로 발광 생물 이미징를 반복합니다. 우리의 실험에서, 우리는 매주 BLI을 수행합니다. D-luciferin 주입 후 30 분 - 우리는 5 이상 자주 노출을 복용하여 주어진 영상 세션의 최대 BLI 신호를 결정하는 선호합니다.
D. 대표 결과
이 stereotactic 주입 기술은 90-100%의 성공적인 종양 - 소요될 속도로 5 % 이상 보통 이하 낮은 perioperative 사망률과 연관되어 있습니다. 의도하지 않은 부작용의 위험이 종양 세포 또는 버 구멍의 부족 폐쇄와 절개 중 하나 심는에서 심실 또는 extracranial 종양 성장에 이식 종양 세포에서 척수의 심는 등의 합병증을 포함, 또한이 기술 부족두개골의 개구를 통해 확장 할 intracranial 종양을 llowing.
종양 xenografts의 예를 생체 분석은 hypoxia의 예상 지역 증가 VEGF 발현 및 괴사을 보여 주었다. 안정적 우리 GBM 세포 라인에 의해 표현 녹색 형광 단백질 (GFP)의 형광 현미경은 이러한 xenografts의 infiltrative 자연을 공개했다.
그림 1은 마우스의 뇌에 GBM 세포의 전형적인 성공 stereotactic 주입의 결과를 보여줍니다. 이 21일 여기에서 설명한 기술을 주입 한 후 9.4 테슬라 자석으로 수행 마우스 뇌의 T2 - 가중 뇌 MRI 검사입니다. 그림 1은 19mm 3 측정 오른쪽 뇌 (분홍색 contoured)에 종양의 단일 초점을 나타 그 주입 사이트의 정확한 좌표에 localizes.
그림 2는 techn를 사용하여 발광 생물 이미징의 결과를 보여줍니다 iques 중 하나 두개골 조사 (4 GY × 4 매일 분수) 또는 전혀 치료를받지 최대 발광 생물 신호 강도에 따라 균일하게 층을 이루게했다 stereotactically 이식 종양과 10 쥐의 그룹은 여기를 설명했다. 이 실험에서 발광 생물 이미징은 신호가 실질적으로 암 세포의 확인란의 선택을 취소 한 확산으로 인한 모방 - 방사능 제어 종양에서 증가하는 반면 방사선 치료가 감지 발광 생물 신호에서 더 증가의 결과로, 주입 된 종양의 확산을 억제 것으로 나타났습니다.
그림 1 (비디오). 종양 볼륨 (핑크)의 윤곽과 U251 glioblastoma multiforme의 종양을 포함하는 마우스 뇌의 MRI 코로나 섹션. 스캔은 9.4 테 슬러 스캐너에 스핀 에코 T2 가중 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 2. stereotactically 이식 glioblastoma multiforme의 종양을 갖춘 10 개 마우스는 외부 빔 방사선 (4) 분수 16 GY으로 치료 또는 전혀 치료 중로 치료했다. 마우스는 치료의 시작 이후 이전에 치료와 매주 발광 생물 이미징과 이미징했다. 그래프는 배 변화가 전처리 최대 BLI 값으로 현재의 최대 BLI 가치의 비율로 정의됩니다 중간 배 변화로 계산 상대 bioluminescence를 제공합니다.
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토론
이 글에 설명 된 쥐 암 세포의 stereotactic 주입의 방법은 reproducibly 합리적으로 임상 glioblastoma multiforme 2, 6-8의 infiltrative 및 빠른 성장 패턴을 요점을 되풀이 종양을 생성합니다. 이 기술은 특히 비교 크기와 생물학적 특성 및 특정 해부학 위치에서 재현 종양 바람직 다른 치료 그룹에 균등하게 쥐를 stratifying 실험에 잘 적합합니다. 우리가 설명하는 기술을 사용하여 종양 세포의 Stereotactic 주입은 대부분의 병진 연구소 7,9-11에 의해 쉽게 달성 할 수 있어야합니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 박사 앤드류 홀랜더, 사라 데이비스, 리 Shuman, 팀 젠킨스와 전문가 도움 박사 Xiangsheng 슈에 감사하고 있습니다. 우리는 박사 앤 케네디의 지원을 인정합니다. BCB는 방사선 생물학 교육 기금 C5T32CA009677에서 지원되었습니다. JFD는 의료 과학자 (1006792)에 대한 버로우즈 웰컴 경력 상에 지원되었다. JLB은 슈퍼 히어로 부여 (5 R25 CA140116-03)에서 지원되었습니다. 우리는 그의 격려와 지원을 우리의 연구가 가능하게 도움이되었습니다 박사 스티브 돼야 해 한이을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 격려와 도움이 의견 펜실베니아 나노 바이오 인터페이스 센터 (NBIC) 및 박사 데니스 Discher 대학을 감사드립니다. 우리는 자신의 MRI 및 광학 / Bioluminescence 핵심 시설 사용을 위해 펜실베니아 대학에서 소형 동물 이미징 시설 (사이프)을 인정합니다. 이 기술은 국립 보건원 (RC1 CA145075 및 K08 NS076548 -에 의해 지원 된 프로젝트의 일환으로 개발01).
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