일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지
Summary
Microglia은 중추 신경계의 방어 및 면역 감시의 첫번째 라인을 제공 macrophages를 거주하고 있습니다. MicroRNAs는 활성화 및 macrophages의 차별화 등 많은 생리 과정에 중요한 역할을 규제 분자입니다. 이 문서에서는 microglia에서 microRNAs의 측정을위한 방법을 설명합니다.
Abstract
Microglia는 중추 신경계 (CNS) 1에 상주 골수양 혈통의 세포입니다. 이러한 세포는 여러 경화증 (MS) 2 등 neuroinflammation과 관련된 많은 질병의 pathologies에 중요한 역할을한다. 정상 CNS의 Microglia는 대식 세포 표시자 CD11b 표현과 같은 CD45와 같은 활성 마커의 낮은 수준을 표현하여 휴식 표현형을 나타냅니다. CNS의 병적인 행사 기간 동안 microglia는 CD45의 upregulation과 다른 마커 3 등의 결정이 활성화된다. microglia의 표현형 및 CNS의 기능에 영향을 미치는 요인을 잘 공부하지 않습니다. MicroRNAs는 (miRNAs) 등 세포 성장과 분화 4와 같은 염증 5와 pathologies 많은 정상적인 생리 과정에 관여하고 보존 분자 (~ 22 세포핵 길이)의 성장하는 가족입니다. MiRNAs가들의 구속력을 보완 시퀀스에서 특정 타겟 유전자의 표현을 downregulateIR mRNAs하고 macrophages 6 microglia 7을 포함하여 타고난 면역 세포의 활성화에 중요한 역할을한다. microglial 표현형, 생물 학적 기능을 정의하고, macrophages 다른 유형에서 microglia를 구별하는 miRNA-매개 경로를 조사하기 위해서는 양적 CNS 상주 microglia의 고유한 하위 집합에서 특정 microRNAs의 표현을 평가하는 것이 중요합니다. CNS의 miRNAs의 표현을 측정하는 일반적인 방법은 전체의 연결 조직에서하고 원위치 하이브리드화의 정량 PCR을 포함합니다. 그러나, 전체 조직 homogenate에서 정량 PCR은의 연결 조직 세포의 유일한 5~15%을 대표 microglia에서 miRNA의 표현의 평가를 허용하지 않습니다. 현장에서 하이브 리다이 제이션은 조직 섹션에서 특정 세포 유형에서 microRNA의 표현의 평가를 가능하지만,이 방법은 전적으로 양적 없습니다. 이 보고서에서는 양적와 SENS을 설명정상 CNS이나 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE), MS에 대한 마우스 모델을 사용 neuroinflammation 동안 격리 microglia의 실시간 PCR에 의한 miRNA의 검출을위한 itive 방식입니다. 설명한 방법은 정상 CNS에서 또는 MS, 뇌졸중, 외상성 부상, 알츠하이머 질환과 뇌종양 등 각종 pathologies과 관련된 neuroinflammation 중 microglia의 microRNAs의 표현의 수준을 측정하는 것이 유용할 것이다.
Protocol
Discussion
최근에는 상당한 관심이 microglia 및 neuroinflammation 및 neurodegeneration와 관련된 많은 pathologies에서 이러한 세포의 관여로 주어졌다. 또한, 면역과 암 세포의 분화에 microRNAs의 역할이 극적으로 지난 몇 년 5,10 이상 성장했습니다. 우리는 이전에 정상 CNS 7 microglia의 비 활성 또는 휴식 표현형의 유지에 미르-124의 역할을보고했지만 microglia의 표현형 및 활성화 상태에있는 microRNAs의 다른 종…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
작품은 NIH R01 NS071039-01A1 연구 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
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