Målet er å overvåke den mitokondrielle redoks staten isolerte hjerter innenfor rammen av fysiologisk forspenning og afterload press. En biventricular arbeider kanin hjerte modell presenteres. Høy spatiotemporal oppløsning fluorescens avbildning av NADH brukes til å overvåke mitokondrielle redoks staten epicardial vev.
Siden starten av Langendorff 1, forblir isolert perfused hjertet en fremtredende verktøy for å studere hjertets fysiologi to. Det er imidlertid ikke godt egnet for studier av hjerte-metabolisme, som krever at hjertet til å utføre arbeid innenfor rammen av fysiologisk forspenning og afterload press. Neely innført endringer av Langendorff teknikk for å etablere hensiktsmessige venstre ventrikkel (LV) forspenning og afterload press 3. Modellen er kjent som den isolerte LV arbeids hjerte modell, og har blitt brukt mye til å studere LV ytelse og metabolisme 4-6. Denne modellen, derimot, gir ikke et riktig lastet høyre ventrikkel (RV). Demmy et al. først rapportert en biventricular modell som en modifikasjon av LV arbeidende hjerte modell 7, 8. De fant at slagvolum, minuttvolum, og press utvikling forbedret i hjerter konverteres fra arbeidslivet LV-modus til biventricular arbeidsmodus 8 </sup>. Et riktig lastet RV minsker også unormale trykkgradienter over septum å forbedre septal funksjon. Biventricular arbeider hjerter har vist seg å vedlikeholde aorta utgang, lunge flyt, mener aorta trykk, puls, og hjerteinfarkt ATP nivåer i opptil 3 timer 8.
Når studere metabolske effekter av skade på hjertet, for eksempel iskemi, er det ofte nødvendig å identifisere plasseringen av det berørte vevet. Dette kan gjøres ved avbildning fluorescens av NADH (redusert form av nikotinamid adenindinukleotid) 9-11, et koenzym som finnes i store mengder i mitokondriene. NADH fluorescens (fNADH) viser en nær lineært inverse forholdet med lokal oksygenkonsentrasjon 12 og gir et mål på mitokondriell redoks staten 13. fNADH bildebehandling under hypoksisk og iskemisk forholdene har blitt brukt som en dye-fri metode for å identifisere hypoksisk regioner 14, 15 og å overvåke utviklingen avhypoksisk forhold over tid 10.
Målet med metoden er å overvåke den mitokondrielle redoks staten biventricular arbeider hjerter i løpet av protokoller som endrer frekvensen av myocyte metabolisme eller indusere hypoksi eller lage en kombinasjon av de to. Hearts fra New Zealand hvite kaniner var koblet til en biventricular jobbe hjerte system (Hugo Sachs Elektronik) og perfused med modifisert Krebs-Henseleit løsning 16 ved 37 ° C. Aorta, LV, lungearterien, og venstre & høyre atrial press ble registrert. Elektrisk aktivitet ble målt ved hjelp av en monofasisk aksjonspotensial elektroden. Slik image fNADH, ble lyset fra en kvikksølvlampe filtrert (350 ± 25 nm) og brukes til å belyse epikard. Lyset ble filtrert (460 ± 20 nm) og avbildes med en CCD-kamera. Endringer i epicardial fNADH av biventricular arbeider hjerter under forskjellige pacefrekvenser presenteres. Kombinasjonen av hjertet modellen og fNADH bildebehandlinggir en ny og verdifull eksperimentell verktøy for å studere akutte kardiale patologi innenfor rammen av realistiske fysiologiske forhold.
Den isolerte Langendorff perfused hjerte forblir en fremtredende verktøy for å studere hjertets fysiologi to. Det er spesielt nyttig i studier av hjertearytmier, spesielt de som bruker fluorescens avbildning av transmembrane potensial 20. En fordel er at hele epikard av den isolerte hjertet kan observeres 21, 22. En annen fordel er at, i motsetning til blod, ikke perfusjon med en klar crystalloid bufferløsning ikke forstyrre fluorescens signaler. En begrensning er at Langendorff teknikken ikke er godt egnet for studier av hjerte-metabolisme, som ofte krever at hjertet til å utføre arbeid innenfor rammen av fysiologisk forspenning og afterload press.
For å heve relevansen av isolerte hjertefeil preparater for metabolske studier, Neely innført endringer i Langendorff teknikken å etablere hensiktsmessige venstre ventrikkel (LV) forspenning og afterload press 3.Modellen er kjent som den isolerte LV arbeids hjerte modell, og har blitt brukt mye til å studere LV ytelse og metabolisme 4-6. LV arbeider hjerte modellen er overlegen til Langendorff modell for funksjonelle evalueringer, men det gir ikke et riktig lastet høyre ventrikkel (RV). Demmy et al. først rapportert en biventricular modell (LV & RV) som en modifikasjon av LV arbeidende hjerte modell 7, 8. De fant at slagvolum, minuttvolum, og press utvikling forbedret i hjerter konverteres fra arbeidslivet LV-modus til biventricular jobbe modus åtte. Et riktig lastet RV forbedrer også septal funksjon ved å svekke unormale trykkgradienter over septum. Biventricular arbeider hjerter har vist seg å vedlikeholde aorta utgang, lunge flyt, mener aorta press, mener pulmonalt trykk, hjertefrekvens og hjerteinfarkt ATP, og kreatinfosfat nivåer i opptil 3 timer 8. Biventricular arbeider hjerte studier bruker vanligvis hjerter frOM små dyr, som for eksempel rotter og kaniner, fordi minuttvolum og den nødvendige volumet av perfusate er mye mindre enn for hjerter av større dyr. Imidlertid har biventricular arbeider hjerte studier blitt utført med hjerter fra svin, hjørnetenner, og selv mennesker 23, 24.
Den metabolske etterspørsel av isolerte hjerter i biventricular driftsfunksjonen er betydelig høyere enn for Langendorff perfusjon. Det er viktig at perfusate løsningen gi nok oksygen og metabolske substrat til støtte biventricular hjertefunksjon. Standard crystalloid buffer løsninger, for eksempel 16 Krebs-Henseleit, 17, 25 eller 26 Tyrodes, 27, har oksygen løselighet så høyt som 5,6 mg / L. Når disse løsningene er gasset med carbogen (en gass blanding av 95% O 2 og 5% CO 2) og inneholde passende metabolsk substrat (glukose, druesukker, og / eller natrium pyruvat), er de egnet for biventricular arbeider hjerter bankende på normal Sinus priser (ca 180 bpm for en kanin).
Metabolske etterspørselen øker for raske rytmer og mengden av oksygen oppløst i standard perfusates kanskje ikke være nok til å gi full støtte en biventricular arbeider hjerte som er oppdragsgiver ved høye priser. Crystalloid bufferløsningene inneholder erytrocytter eller blandet med fullblod har vært brukt i arbeidstiden hjerte forberedelser for å sikre tilstrekkelig oksygen tilgjengelighet. Tidligere studier har vist at å legge erytrocytter til en Krebs-Henseleit løsning bedre arbeidsmiljø hjertefunksjonen under strenge pacing protokoller og også redusert forekomst av ventrikkelflimmer 16. En begrensning av bruk av erytrocytter eller blandinger av fullblod er at hemoglobin forstyrrer lysbølgelengder som brukes for fluorescens bildebehandling 13. Andre underlag, for eksempel albumin, kan også legges til perfusate løsninger for å forlenge hjerte levedyktighet og redusere ødem 28.
Under fluorescens avbildning intensiteten av eksitasjon lys bør være høy og lys fordelingen bør være ensartet. Oppnå jevn belysning er ikke alltid lett på grunn av krumning av epicardial overflaten. I våre studier har vi bilde fNADH ved å filtrere lys (350 ± 25 nm) fra en kvikksølv lampe. En splittnagler fiberoptisk lys guide brukes til å dirigere UV-lys på epicardial overflaten. Uniform belysning kan oppnås ved riktig posisjonering de to output endehylser. UV LED lyskilder kan også brukes, som vi har vist i Figur 3. LED kilder er relativt billig så flere kilder kunne innlemmes i en avbildning system. LED kan også syklet på og av ved høye priser for å synkronisere eksitasjon lys med bilde oppkjøpet.
Photobleaching av NADH bør minimaliseres 29 ved å redusere tiden av vev belysning. Dette kan gjøres ved å sykle belysningen på og av med et elektronic lukkeren og en lampe eller med en LED belysning system og en kontroller. Dersom belysning er synkronisert med hjertets syklus, så fNADH bilde oppkjøpet kan bli bundet til diastole, noe som ville redusere bevegelse gjenstand i fluorescens signaler. Trigging belysning og bilde innsamlingen med et trykk signal, som LV press, ville være en måte å gjøre dette.
I våre studier har vi sett at endringer i fNADH per tidsenhet kan være mer enn 5x høyere ved 400 bpm enn på 200 bpm. Dette indikerer at raske rytmer heve redoks staten hjertet. Hvorvidt dette er forårsaket av hypoksi eller manglende evne myocytes å oksidere NADH til NAD + raskt nok til å unngå opphopning av NADH er fortsatt et ubesvart spørsmål.
Ytelsen til en biventricular jobbe hjerte forberedelse er betinget av flere faktorer. En av de viktigste er å stille egnede forspenning og afterload press for å etterligne den fysiologiskeforhold som er under etterforskning. Spesielt må LV afterload (aorta trykk) justeres for å representere systemisk press. Hvis den er for høy, vil LV ikke kunne overvinne trykket, noe som resulterer i oppgulp. Trykk som er for lavt, vil påvirke koronar perfusjon. LV preload trykket (til venstre atrie trykk) bør også tilpasses for å gi en slutt diastolisk volum som passer for den forsøksprotokoll.
fNADH avbildning av levende vev er en etablert måte å fluorescens bildebehandling 13. Sin søknad til hjertevev ble illustrert av Barlow og Chance da de rapporterte slående forhøyelser av fNADH innenfor regionalt iskemisk vev etter ligation av en koronar fartøy 14. Deres fNADH bildene ble tatt på film med en Fairchild oscilloskop kamera og UV blitsfotografering. Coremans et al. utdypes dette konseptet bruker NADH fluorescens / UV refleksjon forhold til å målee det metabolske tilstand epikard av Langendorff blod-perfused rotte hjerter 30. En videofluorimeter ble brukt for bildebehandling og data ble registrert ved hjelp av en video-opptaker. Senere Scholz et al. brukt en spektrograf og fotodiode utvalg for å måle gjennomsnittlig fNADH fra et stort område av LV. Denne tilnærmingen reduserte effekten av epikardiale fluorescens heterogeniteter og lokale variasjoner i omløp mens avslørende makroskopiske arbeidsrelaterte varianter av fNADH 31. Denne tilnærmingen er lik databehandling gjennomsnittlig fNADH nivåer for en region av interesse på tvers av alle rammer i en fNADH bildebehandling datasettet, som illustrert i figur 2. Som vi har presentert i denne artikkelen, gir dagens teknologi høyhastighetstog CCD-kameraer og digitalt kontrollert kraftige UV spotlights. Disse teknologiene gjør de spatiotemporal dynamikken i fNADH og hjerte metabolisme å bli studert fra mange nye perspektiver. Den relativt lave kostnaden av optikk og lyskilde gjør fNADH bildebehandling en nyttig tilbehør for konvensjonelle kardiale optiske kartsystemer. 9, 32
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra NIH (R01-HL095828 til MW Kay).
Chemical | Company | Catalogue Number |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911-500G |
CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 |
KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968-500G |
NaPyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256-25G |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418-100G |