Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas
Summary
Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias Ca<sup> 2 +</sup> Manejo, el volumen potencial de membrana mitocondrial y mitocondrial. El procedimiento para la obtención de corazón de alta calidad y las mitocondrias funcionales también se describe.
Abstract
El poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mtPTP) es un canal no específico que se forma en la membrana mitocondrial interna para el transporte de solutos con una masa molecular inferior a 1,5 kDa. Aunque la identidad definitiva molecular del poro está todavía en debate, proteínas como la ciclofilina D, VDAC y ANT contribuir a mtPTP formación. Si bien la participación de la apertura mtPTP en la muerte celular está bien establecida 1, la evidencia acumulada indica que la mtPTP cumple un papel fisiológico durante mitocondrial homeostasis del Ca 2 + 2, la bioenergética y señalización redox 3.
apertura mtPTP se desencadena por matriz Ca 2 +, pero su actividad puede ser modulada por varios otros factores tales como el estrés oxidativo, el agotamiento de nucleótidos de adenina, altas concentraciones de Pi, despolarización de la membrana mitocondrial o desacoplamiento, y ácidos grasos de cadena larga 4. In vitro, mtPTP apertura puede ser ACHieved mediante el aumento de la concentración de Ca2 + en el interior de la matriz mitocondrial a través de adiciones exógenas de Ca 2 + (capacidad de retención de calcio). Cuando los niveles de Ca 2 + dentro de las mitocondrias alcanzar un cierto umbral, la mtPTP abre y facilita la liberación de Ca 2 +, la disipación de la fuerza motriz de protones, la membrana potencial de colapso y un aumento de volumen de la matriz mitocondrial (hinchazón) que en última instancia conduce a la ruptura de la membrana mitocondrial externa y la pérdida irreversible de la función del orgánulo.
Aquí se describe un ensayo fluorométrico que permite una caracterización exhaustiva de apertura mtPTP en mitocondrias aisladas de corazón de ratón. El ensayo involucra la medición simultánea de 3 parámetros mitocondriales que son alterados cuando se produce la apertura mtPTP: mitocondrial de Ca 2 manejo + (absorción y liberación, medida por Ca 2 + de concentración en el medio de ensayo), el potencial de membrana mitocondrial, y mitochovolumen ndrial. Los colorantes empleados para la medición de Ca 2 + en el medio de ensayo del potencial de membrana mitocondrial son Fura FF, una membrana impermeabilizante, indicador radiométrica que sufre un cambio en la longitud de onda de excitación en presencia de Ca 2 +, y JC-1, un catiónico, indicador radiométrica que forma monómeros verdes o rojos agregados en el potencial de membrana de alta y baja, respectivamente. Cambios en el volumen mitocondrial se midió registrando dispersión de la luz por la suspensión mitocondrial. Dado de alta calidad, las mitocondrias funcionales son necesarias para el ensayo de apertura mtPTP, también se describe los pasos necesarios para obtener corazón intacto, altamente acoplado y funcional mitocondrias aisladas.
Protocol
Discussion
El protocolo presentado aquí describe los pasos necesarios experimentales para evaluar la permeabilidad de la apertura del poro de transición en el corazón mitocondrias aisladas (Figura 1 y Figura 4): el procedimiento para el aislamiento de corazón de ratón mitocondrias, los controles de las vías respiratorias que garanticen su integridad y funcionalidad, los parámetros monitoreados durante mitocondriales mtPTP apertura y los colorantes empleados para su medición, la creación d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por HL094536 (BJH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O’Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP – Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
