Isolering af embryoniske crista neuralis fra neuralrøret letter anvendelsen af<em> In vitro</em> Metoder til at studere migration, selvfornyelse, og multipotency af neural crest.
Den embryoniske crista neuralis (NC) er en multipotent progenitorcelle population, der stammer fra den dorsale aspekt af neuralrøret, undergår en epitelcelle til mesenchymal overgang (EMT) og migrerer gennem embryo, hvilket giver anledning til forskellige celletyper 1-3. NC har også den unikke evne til at påvirke differentiering og modning af målorganer 4-6. Når eksplanteret in vitro, NC progenitorer undergår selvfornyelse, migrerer og differentierer til en række forskellige vævstyper, herunder neuroner og glia, glatte muskelceller, brusk og knogler.
NC multipotency blev først beskrevet af eksplantater af aviær neuralrøret 7-9. In vitro isolering af NC-celler letter undersøgelsen af NC dynamik, herunder proliferation, migration og multipotency. Det videre arbejde i de fugle og rotter systemer viste, at eksplanterede NC-celler bevarer deres NC potentiale, når transplanteres tilbage til fosteret 10-13. Fordi disse iboende cellulære egenskaber er bevaret i eksplanterede NC stamfædre, neuralrøret explantet analysen forsyner en attraktiv mulighed for at studere NC in vitro.
At opnå en bedre forståelse af den mammale NC, er mange metoder blevet anvendt til at isolere NC populationer. NC-afledte progenitorceller kan dyrkes fra post-migrerende steder i både embryo og voksne at studere dynamikken af post-migrerende NC progenitorer 11,14-20 imidlertid isolering af NC progenitorer, da de emigrere fra neuralrøret tilvejebringer optimal konservering af NC celle potentiale og migrerende egenskaber 13,21,22. Nogle protokoller anvender fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at isolere en NC population er beriget for bestemte progenitorer 11,13,14,17. Imidlertid, når der startes med tidlige embryoer, celleantal passende for analyser er vanskeligt at opnå med FACS, komplicerer isolering af tidlige NC populations fra individuelle embryoer. Her beskriver vi en tilgang, som ikke er afhængig af FACS og resultater i en ca 96% ren NC befolkning baseret på en Wnt1-Cre aktiveret slægt reporter 23.
Fremgangsmåden fremlagt her, er tilpasset fra protokoller optimeret til dyrkning af rotte-NC 11,13. Fordelene ved denne protokol i forhold til tidligere metoder er, at 1) at cellerne ikke dyrkes på et fødelag, 2) FACS ikke nødvendig for at opnå en relativt ren population NC, 3) premigratory NC celler isoleres og 4) resultaterne er let kvantificeret. Endvidere kan denne protokol kan anvendes til isolering af NC fra enhver mutant musemodel, letter undersøgelsen af NC egenskaber med forskellige genetiske manipulationer. Begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at NC fjernes fra rammerne af embryo, som vides at påvirke overlevelse, migration og differentiering af NC 2,24-28.
Omhyggelig bør man være opmærksom på udviklingsstadiet af embryo for at sikre succes for denne tilgang. Optælling somitter af tidlige museembryoer er kritisk for både fase matche embryoner inden for et kuld hvalpe og bestemme de korrekte områder af neuralrøret for isolation. En variation af en eller to somitter mellem embryoer er inden for et rimeligt udvalg af udviklingsmæssige timing, afhængigt af opløsningen af den gennemførte forsøget. Et embryo mellem 9 og 9,5 DPC vil have mellem 17 og 25 somitte…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende Marc Wozniak til video assistance. Vi vil også gerne takke Sean Morrison på UT Southwestern for den oprindelige protokol for dyrkning af rotte NC celler. Dette arbejde blev støttet Vanderbilt University Medical Center Akademisk Program Support og ved tilskud fra NIH (HD36720 og HD036720-11S109) og AHA 11GRNT7690040 til PAL, predoctoral stipendier fra AHA (0615209B) og NIH (NS065604) til NAM, og ERP var understøttet af en NIH træning tilskud T32HD007502.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (low glucose) | Gibco/Invitrogen | 11885 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
BSA | Sigma | A3912-10G | |
dPBS | Gibco | 14190-144 | |
IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C. |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C. |
Fibronectin | Gibco | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C. |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C. |
2-mercaptoethanol | Sigma | D-5637 | |
N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Steriflip 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
Four well plates | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
Collagenase/Dispase | Roche | 269 638 | Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C. |
Insulin needles (29½ gage) |
Becton Dickson | 309306 | |
Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg | ||
Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg | ||
Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 |