Isolering og dyrkning af neurale kamceller fra embryonale Murin Neural Tube

Summary

Isolering af embryoniske crista neuralis fra neuralrøret letter anvendelsen af<em> In vitro</em> Metoder til at studere migration, selvfornyelse, og multipotency af neural crest.

Abstract

Den embryoniske crista neuralis (NC) er en multipotent progenitorcelle population, der stammer fra den dorsale aspekt af neuralrøret, undergår en epitelcelle til mesenchymal overgang (EMT) og migrerer gennem embryo, hvilket giver anledning til forskellige celletyper ^1-3. NC har også den unikke evne til at påvirke differentiering og modning af målorganer ^4-6. Når eksplanteret in vitro, NC progenitorer undergår selvfornyelse, migrerer og differentierer til en række forskellige vævstyper, herunder neuroner og glia, glatte muskelceller, brusk og knogler.

NC multipotency blev først beskrevet af eksplantater af aviær neuralrøret ^7-9. In vitro isolering af NC-celler letter undersøgelsen af NC dynamik, herunder proliferation, migration og multipotency. Det videre arbejde i de fugle og rotter systemer viste, at eksplanterede NC-celler bevarer deres NC potentiale, når transplanteres tilbage til fosteret ¹⁰-13. Fordi disse iboende cellulære egenskaber er bevaret i eksplanterede NC stamfædre, neuralrøret explantet analysen forsyner en attraktiv mulighed for at studere NC in vitro.

At opnå en bedre forståelse af den mammale NC, er mange metoder blevet anvendt til at isolere NC populationer. NC-afledte progenitorceller kan dyrkes fra post-migrerende steder i både embryo og voksne at studere dynamikken af post-migrerende NC progenitorer ^11,14-20 imidlertid isolering af NC progenitorer, da de emigrere fra neuralrøret tilvejebringer optimal konservering af NC celle potentiale og migrerende egenskaber ^13,21,22. Nogle protokoller anvender fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at isolere en NC population er beriget for bestemte progenitorer ^11,13,14,17. Imidlertid, når der startes med tidlige embryoer, celleantal passende for analyser er vanskeligt at opnå med FACS, komplicerer isolering af tidlige NC populations fra individuelle embryoer. Her beskriver vi en tilgang, som ikke er afhængig af FACS og resultater i en ca 96% ren NC befolkning baseret på en Wnt1-Cre aktiveret slægt reporter ^23.

Fremgangsmåden fremlagt her, er tilpasset fra protokoller optimeret til dyrkning af rotte-NC ^11,13. Fordelene ved denne protokol i forhold til tidligere metoder er, at 1) at cellerne ikke dyrkes på et fødelag, 2) FACS ikke nødvendig for at opnå en relativt ren population NC, 3) premigratory NC celler isoleres og 4) resultaterne er let kvantificeret. Endvidere kan denne protokol kan anvendes til isolering af NC fra enhver mutant musemodel, letter undersøgelsen af ​​NC egenskaber med forskellige genetiske manipulationer. Begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at NC fjernes fra rammerne af embryo, som vides at påvirke overlevelse, migration og differentiering af NC ^2,24-28.

Protocol

1. Forbereder Plader Anvendelse af steril teknik til enhver tid. Forberede fibronectin (FN) ved at fortynde 100 pi humant plasma FN lager til et slutvolumen på 3,3 ml i Dulbeccos PBS (DPBS). Endelige koncentration 30 ug / ml, og dette kan opbevares ved 4 ° C i 1 uge. Omfatter bunden af ​​hver brønd i en steril vævskulturplade fire brønde med FN-opløsning og lad henstå i 15 minutter. Sørg for, at hele overfladen er dækket. Gør mediet i denne periode (trin 2 og 3). Fj…

Discussion

Omhyggelig bør man være opmærksom på udviklingsstadiet af embryo for at sikre succes for denne tilgang. Optælling somitter af tidlige museembryoer er kritisk for både fase matche embryoner inden for et kuld hvalpe og bestemme de korrekte områder af neuralrøret for isolation. En variation af en eller to somitter mellem embryoer er inden for et rimeligt udvalg af udviklingsmæssige timing, afhængigt af opløsningen af ​​den gennemførte forsøget. Et embryo mellem 9 og 9,5 DPC vil have mellem 17 og 25 somitte…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM (low glucose)	Gibco/Invitrogen	11885
Neurobasal Medium	Gibco	21103
BSA	Sigma	A3912-10G
dPBS	Gibco	14190-144
IGF1	BD Biosciences	354037	Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C.
bFGF	BD Biosciences	354060	Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C.
Fibronectin	Gibco	33016-015	Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C.
Retinoic acid	Sigma	R2625	Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C.
2-mercaptoethanol	Sigma	D-5637
N2 supplement	Gibco	17502-048
B27 supplement	Gibco	17504-044
Steriflip 0.22 μm filters	Millipore	SCGP00525
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140122
0.20 μm filters	Corning	431219
Syringes (for filtration)	BD Biosciences	301604
Four well plates	Thermo Fisher Scientific	176740
Collagenase/Dispase	Roche	269 638	Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C.
Insulin needles (29½ gage)	Becton Dickson	309306
Hypoxia Chamber	Billups-Rothenberg
Oxygen Analyzer	Billups-Rothenberg
Forceps #5	Fine Science Tools		For removing uterus and decidua.
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200