जीन अभिव्यक्ति मशीनरी की कार्यात्मक assays के लिए छोटे पैमाने पर परमाणु अर्क
Summary
मजबूत, छोटे पैमाने पर HeLa परमाणु अर्क की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. यह प्रोटोकॉल assays कि दवाओं या आरएनएआई के साथ इलाज किया कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं की छोटी आबादी, के उपयोग की आवश्यकता के लिए बहुमूल्य है. विधि जीन अभिव्यक्ति assays और रोगी कोशिकाओं सहित अन्य प्रकार सेल, की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू होना चाहिए.
Abstract
समझ जीन अभिव्यक्ति में प्रगति का एक बड़ा सौदा इन विट्रो प्रणालियों में उपयोग किया गया है. सबसे अध्ययन के लिए, कार्यात्मक assays के निष्कर्षों की है कि थोक में निलंबन में विकसित कोशिकाओं की 10-50 या उससे अधिक लीटर से तैयार कर रहे हैं का उपयोग किया जाता है. हालांकि, इन बड़े पैमाने पर तैयारी तेजी से परीक्षण करने के लिए उत्तरदायी इन विट्रो प्रभाव में नहीं हैं कि परिणाम में vivo सेलुलर उपचार या स्थितियों में की एक किस्म से. यह पत्रिका वीडियो लेख कार्यात्मक छोटे पैमाने पर परमाणु अर्क की तैयारी, एक उदाहरण के रूप में HELA कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक विधि से पता चलता है. इस विधि से बाहर पक्षपाती monolayers के रूप में विकसित कोशिकाओं के रूप में कुछ के रूप में तीन 150 मिमी प्लेट का उपयोग किया जाता है. लघु निष्कर्षों की दक्षता का वर्णन करने के लिए, हम बताते हैं कि वे के रूप में युग्मित शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन / splicing प्रतिक्रियाओं के लिए थोक परमाणु अर्क के रूप में सक्रिय हैं. निकालने प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शन, हम बताते हैं कि splicing HeLa सेल से तैयार अर्क में समाप्त कर दिया हैsplicing के अवरोध करनेवाला दवा E7107 के साथ इलाज किया. लघु प्रोटोकॉल आम तौर पर किसी भी प्रक्रिया या कोशिका प्रकार है कि इन विट्रो में जांच की जा सकता है सेलुलर निष्कर्षों का उपयोग करने के लिए लागू होना चाहिए. रोगी कोशिकाओं है कि केवल सीमित मात्रा में या कोशिकाओं दवाओं, डीएनए हानिकारक एजेंटों, आरएनएआई, या अभिकर्मक, जो छोटे सेल आबादी के उपयोग की आवश्यकता के रूप में कई एजेंटों के लिए संपर्क में उपलब्ध हैं शामिल हैं. इसके अलावा, हौसले से विकसित कोशिकाओं की छोटी मात्रा में सुविधाजनक और / या कुछ अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हैं.
Protocol
Discussion
हम HeLa monolayers के रूप में विकसित कोशिकाओं की छोटी मात्रा से परमाणु निष्कर्षों की तैयारी के लिए एक तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि की स्थापना की है. हमने दिखा दिया है कि इन निष्कर्षों दिखा रहा है कि RNAP द्वितीय / प्रतिलेखन और splicing assays के कैनेटीक्स और दक्षता छोटे पैमाने पर और थोक परमाणु अर्क में समान हैं द्वारा मजबूत कर रहे हैं. हम प्रदर्शन है कि एक splicing अवरोध करनेवाला दवा के साथ इलाज किया कोशिकाओं से तैयार अर्क प्रतिलेखन लेकिन splicing में दोषपूर्ण के लिए सक्रिय हैं अर्क की उपयोगिता से पता चला.
छोटे पैमाने पर परमाणु अर्क तैयार करने के लिए हमारी पद्धति संयोजन और अनुकूलन पहले HELA कोशिकाओं से निष्कर्षों 1,8 बड़े पैमाने में निलंबन में वृद्धि हुई और 9 के अर्क के छोटे पैमाने पर तैयारी के लिए एक विधि बनाने के लिए स्थापित तरीकों द्वारा स्थापित किया गया था. हम हमारे प्रोटोकॉल की स्थापना की है क्योंकि पिछले लघु निष्कर्षों कुछ assays के लिए कार्यात्मक, मिलकर प्रतिलेखन / सपा के रूप में नहीं थेपरख licing. पिछले लघु 9 प्रोटोकॉल और हमारे बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है कि हम एक dounce मिनी का उपयोग lysing कोशिकाओं के लिए शर्तों को अनुकूलित किया है जबकि पिछले प्रोटोकॉल उन्हें एक छोटे गेज सुई के माध्यम से 9 धकेलने के द्वारा कोशिकाओं lysed. बुलबुले में सुई lysis परिणाम है, जो समझा जा सकता है क्यों निष्कर्षों को निष्क्रिय और / या मुश्किल कुछ assays के लिए पुन: पेश करने थे. हम भी एक एकाग्रता हमारी प्रोटोकॉल के लिए कदम जोड़ा. यह कदम अर्क, जो अत्यंत एकाग्रता के प्रति संवेदनशील हैं की गतिविधि बढ़ जाती है, और भी सीमा अर्क के बीच परिवर्तनशीलता है कि छोटे पैमाने पर तैयारी करने के लिए निहित है. अंत में, हमारी तैयारी नियमित monolayer की कोशिकाओं के तीन केवल 150 मिमी प्लेट के साथ बाहर गतिविधि पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव थोक निष्कर्षों की तुलना में बिना किया जाता है. इस प्रकार, प्रक्रिया आसानी से छोटे पैमाने पर तैयारियाँ कि महंगा अभिकर्मकों या सीमित कक्ष उपलब्धता की आवश्यकता के लिए उत्तरदायी है. उदाहरण के लिए, हम sma तैयार हैआरएनएआई पछाड़ना कोशिकाओं से और चिरकारी Lymphocytic लेकिमिया (CLL) रोगी कोशिकाओं से करेंगे पैमाने पर अर्क, और कार्यात्मक और / या जैव रासायनिक assays (EGF, JLH, TY और आर आर, अप्रकाशित) के लिए इन निष्कर्षों का इस्तेमाल किया. हमने पाया है कि मूल्यवान अर्क के लिए आरएनएआई immunopreciptations, पाश्चात्य, और चांदी धुंधला जैसे विशिष्ट जैव रासायनिक assays, द्वारा पीछा किया. नीचे एक विशेष प्रोटीन दस्तक की प्रभावकारिता की स्थापना के बाद, एक स्थिर सेल लाइन पछाड़ना है, जो कम लागत पर अतिरिक्त अर्क तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बनाने के द्वारा एक अधिक विस्तृत अध्ययन बाहर ले सकते हैं. प्रोटीन का मास स्पेक्ट्रोमेट्री में मौजूद इन पछाड़ना सेल लाइनों से प्राप्त immunoprecipitates भी विधि का एक उपयोगी आवेदन किया जाएगा. मिलकर परख / प्रतिलेखन splicing है कि हम हमारे प्रोटोकॉल विवरण यहाँ के लिए एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल करने के अलावा, लघु निष्कर्षों को आम तौर पर कई कार्यात्मक और जैव रासायनिक assays के लिए लागू विभिन्न सेंट के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में होना चाहिएजीन अभिव्यक्ति में eps (कैपिंग, splicing है, प्रतिलेखन, polyadenylation, microRNA प्रसंस्करण जैसे). प्रोटोकॉल भी रोगी कोशिका प्रकार है कि या तो निलंबन में प्राप्त किया जा सकता है (जैसे CLL कोशिकाओं के रूप में) या संस्कृति में हो (जैसे रोगी fibroblasts) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. अंत में, cytoplasmic प्रक्रिया के दौरान प्राप्त अंश दोनों कार्यात्मक और जैव रासायनिक assays कि cytoplasm आवश्यकता होती है के लिए उपयोगी साबित करना चाहिए.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Winkelbauer – चोट, एम. ई. इब्राहिम, पी. वालेंसिया, लालकृष्ण दू फ़ू, एच. चेंग उपयोगी विचार विमर्श के लिए आभारी हैं. HELA कोशिकाओं राष्ट्रीय सेल संस्कृति केंद्र (Minneapolis, MN) से प्राप्त किया गया. हम भी हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में E7107 और Nikon इमेजिंग सेंटर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ मदद के लिए उपलब्ध कराने के लिए Eisai कं, लिमिटेड धन्यवाद. यह काम एक NIH GM043375 अनुदान आरआर और EGF और एनआरएसए फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया JLH.
Materials
| Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
| HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
| MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
| KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
| PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
| DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
| EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
| Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
| DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
| FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
| 150mm Plates | VWR | 353025 | |
| Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
| Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
| Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
| Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
| Solution | Final | Stock | Dispense |
| Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
| 10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
| 100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
| 20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.
References
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