Ett protokoll för beredning av robusta, småskaliga HeLa nukleära extrakt beskrivs. Detta protokoll är värdefull för analyser som kräver användningen av små populationer av celler, såsom celler som behandlats med läkemedel eller RNAi. Metoden bör vara tillämplig på en mängd olika analyser genuttryck och andra celltyper, inklusive patientens celler.
En stor del av framsteg i förståelsen av genuttryck har gjorts med in vitro-system. För de flesta studier har funktionella analyser utfördes med användning av extrakt som framställs i bulk från 10-50 eller flera liter celler odlade i suspension. Dessa storskaliga preparat inte mottagliga för att snabbt testa in vitro effekter som är resultatet av en mängd olika in vivo cellulära behandlingar eller villkor. Denna skrift video artikeln visar en metod för framställning av funktionella småskaliga nukleära extrakt, med användning av HeLa-celler som ett exempel. Denna metod utförs med användning av så få som tre 150 mm plattor av celler odlade såsom vidhäftande monolager. För att illustrera effektiviteten i småskaliga extrakt, visar vi att de är lika aktiva som bulk nukleära extrakt för kopplade RNA-polymeras II transkription / skarvning reaktioner. För att visa användbarheten av extraktet protokoll, visar vi att splitsning upphävs av extrakt framställda från HeLa-cells behandlas med splitsning inhibitorn läkemedlet E7107. Det småskaliga protokoll bör vara allmänt tillämpas på alla processer eller celltyp som kan undersökas in vitro med cellulära extrakt. Dessa inkluderar patientens celler som endast är tillgängliga i begränsade mängder eller celler som utsätts för ett stort antal medel såsom läkemedel, DNA-skadande ämnen, RNAi, eller transfektion, som kräver användning av små cellpopulationer. Dessutom kan små mängder av färskt odlade celler är lämpligt och / eller erfordras för vissa applikationer.
Vi har etablerat en snabb och reproducerbar metod för framställning av nukleära extrakt från små mängder av HeLa-celler odlas som monoskikt. Vi visade att dessa utdrag robusta genom att visa att kinetiken och effektiviteten i RNAP II transkription / skarvning analyser är liknande i de småskaliga och bulk nukleära extrakt. Vi visade användbarheten av extrakt genom att visa att extrakt framställda från celler som behandlats med en splitsning hämmare läkemedel som är aktiva för transkription men defekt i splitsning.
Vår metod för att framställa små nukleära extrakt grundades genom att kombinera och optimera metoder som tidigare fastställts för att göra extrakt från HeLa-celler odlas i suspension i stor skala 1,8 och en metod för småskalig beredning av extrakt 9. Vi etablerat vårt protokoll eftersom de tidigare småskaliga extrakt inte fungerar för vissa analyser, såsom den kopplade transkription / splicing analys. En viktig skillnad mellan den tidigare småskaliga protokoll 9 och vår är att vi optimerat förutsättningarna för lysera celler med användning av mini-Dounce medan det tidigare protokollet lyseras cellerna genom att skjuta dem genom en liten nål 9. Nålen-lys resulterar i bubblor, som kan förklara varför extrakten var inaktiva och / eller svårt att reproducera för vissa analyser. Vi har även lagt en koncentration steg för att våra protokoll. Detta steg ökar aktiviteten av extrakten som är extremt känsliga för koncentration, och även begränsar variationen mellan extrakt som är inneboende i småskaliga preparat. Slutligen våra förberedelser rutinmässigt utföras med endast tre 150 mm plattor av monoskiktceller, utan någon signifikant effekt på aktivitet jämfört med bulk extrakt. Således är förfarandet lätt mottaglig för småskaliga preparat som kräver kostsamma reagenser eller begränsad cell tillgänglighet. Till exempel har vi förberett smaLL-skala extrakt från RNAi knockdown celler och från kronisk lymfatisk leukemi (KLL) patientens celler och använde dessa utdrag funktionella och / eller biokemiska analyser (EGF, JLH, TY och RR, opublicerad). Vi har funnit att de extrakt är värdefulla för RNAi följt av specifika biokemiska analyser, såsom immunopreciptations, Westerns och silverfärgning. Efter att ha utarbetat effekten av riva ned ett visst protein, kan en mer detaljerad studie utföras genom att göra en stabil knockdown cell-linje, som kan användas för att förbereda ytterligare utdrag till lägre kostnad. Masspektrometri av proteiner som förekommer i immunutfällningar som erhållits från dessa linjer knockdown cell kommer också att vara en användbar tillämpning av metoden. Förutom den kopplade transkription / skarvning analys som vi använde som exempel för vår protokollet beskrivning här, bör småskaliga extrakt vara tillämplig för många funktionella och biokemiska analyser, såsom de som används för de olika stEPS i genuttryck (t.ex. capping, splitsning, transkription, polyadenylering, mikroRNA bearbetning). Protokollet kan även anpassas för patientens celltyper som kan vara antingen som erhållits i suspension (såsom CLL-celler) eller odlas i kultur (t.ex. patientens fibroblaster). Slutligen bör den cytoplasmatiska fraktionen som erhållits under förfarandet visa sig vara användbara för både funktionella och biokemiska analyser som kräver cytoplasman.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng för användbara diskussioner. HeLa-celler erhölls från National Cell Culture Center (Minneapolis, MN). Vi tackar också Eisai Co, Ltd för att tillhandahålla E7107 och Nikon Imaging Center vid Harvard Medical School för hjälp med ljusmikroskop. Detta arbete stöddes av en NIH bidrag GM043375 RR och fonden och NRSA gemenskap med JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.