En kvantitativ utvärdering av cellmigration genom Phagokinetic Track Motility analys
Summary
Den phagokinetic motilitet spåret analysen är en metod som används för att bedöma rörlighet celler. Specifikt mäter analysen kemokines (slumpvis cellmotilitet) över tid i ett kvantitativt sätt. Analysen utnyttjar förmågan hos celler att skapa en mätbar spår av deras rörelse på kolloidala guld-belagda täckglas.
Abstract
Cellulär motilitet är en viktig biologisk process för både encelliga och flercelliga organismer. Det är viktigt för förflyttning av encelliga organismer till en källa av näringsämnen eller bort från olämpliga förhållanden samt i flercelliga organismer för mjukpapper utveckling, immunförsvaret övervakning och sårläkning, bara för att nämna några roller 1,2,3. Avregleringen av denna process kan leda till allvarliga neurologiska, kardiovaskulära och immunologiska sjukdomar samt förvärras tumörbildning och sprida 4,5. Molekylärt har aktinpolymerisering och receptor återvinning visats spela viktiga roller i att skapa cellulära förlängningar (lamellipodia), som driver den framåtgående rörelsen av cellen 6,7,8. Men många biologiska frågor om cellmigration förblir obesvarade.
Den centrala roll cellulär motilitet i människors hälsa och sjukdomar understryker vikten av att förstå den specifika MEChanisms involverade i denna process och gör noggranna metoder för att utvärdera cellmotiliteten särskilt viktig. Mikroskop används vanligen för att visualisera rörelse av celler. Men cellerna rör sig ganska långsamt, vilket gör kvantitativ mätning av cellmigration en resurskrävande process som kräver dyra kameror och programvara för att skapa kvantitativa tid löpt filmer av rörliga celler. Därför är förmågan att utföra en kvantitativ mätning av cellmigration som är kostnadseffektiv, icke-mödosamma, och som använder gemensam laboratorieutrustning ett stort behov av många forskare.
Den phagokinetic spåret motilitet analys utnyttjar förmågan hos en rörlig cell att rensa guldpartiklar från sin bana för att skapa en mätbar spår på en kolloidalt guld-belagt täckglas 9,10. Med användning av allmänt tillgänglig mjukvara, kan flera spår utvärderas för varje behandling för att åstadkomma statistikkraven. Analysen kan användas för att bedömamotilitet av många celltyper, såsom cancerceller 11,12, fibroblaster 9, neutrofiler 13, skelettmuskelceller 14, keratinocyter 15, 16 trofoblaster, endotelceller 17 och monocyter 10,18-22. Protokollet involverar skapandet av objektglas belagda med guld nanopartiklar (Au °) som genereras av en reduktion av klorguldsyra (Au 3 +) av natriumcitrat. Denna metod har utvecklats av Turkevich et al. Under 1951 23 och därefter förbättrats under 1970-talet av Frens et al. 24,25. Som ett resultat av denna kemiska reduktionssteg, guldpartiklar (10-20 nm i diameter) utfällning från reaktionsblandningen och kan tillämpas på täckglas, som är därefter färdig för användning i cellulära analyser migration 9,26,27.
I allmänhet, är det phagokinetic spåret motilitet analys en snabb, kvantitativ och enkel mätning av cellulär motilitet. Dessutom är detkan användas som en enkel hög genomströmning analys, för användning med celltyper som inte är mottagliga för tid-bortfallit avbildning, liksom andra användningar, beroende på behoven av forskaren. Tillsammans, förmågan att kvantitativt mäta cellulär motilitet av flera celltyper utan behov av dyra mikroskop och programvara, tillsammans med användning av gemensamma laboratorieutrustning och kemikalier, gör phagokinetic spår motilitet test en solid val för forskare med intresse för att förstå cellulära motilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den phagokinetic spår motilitet test presenteras i denna artikel är en enkel och mycket effektiv metod för kvantitativ analys av cellmigration. Eftersom flera celltyper kan analyseras 9-17, har denna metod den potentiella breda användningen över flera discipliner. Användningen av kolloidala guld-belagda täckglas medger mätning av ett spårområde raderas genom en rörlig cell. Analysen kan mäta effekten av olika stimuli (dvs. tillväxtfaktorer, renade ECM ligander, virus, bakterier) på cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (AI050677, HD-051.998, och GM103433), en Malcolm Feist kardiovaskulär forskning gemenskap och en American Heart Association predoctoral gemenskap (10PRE4200007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Glass Coverslips (15 mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. |
References
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
- Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
- Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
- Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
- Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, 379-392 (2010).
- Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
- Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
- Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
- Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
- Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
- McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
- Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
- Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
- Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
- Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
- Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
- Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
- Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
- Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
- Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
- Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
- Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
- Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
- Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).
