Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Summary

Dopamin wird deutlich im Mittelhirn Kerne, die den Zellkörper und Dendriten der Dopamin-Neuronen enthalten geregelt. Hier beschreiben wir eine Dissektion und Probe-Handling-Ansatz, um Ergebnisse zu maximieren, und damit Schlussfolgerungen und Erkenntnisse, auf die Dopamin-Regulierung im Mittelhirn Kerne der Substantia nigra (SN) und ventralen Tegmentum (VTA) bei Nagern.

Abstract

Dopamin ist ein kräftig studierte Neurotransmitter im ZNS. In der Tat hat sein Engagement in der Bewegungsaktivität und Lohn-bezogenen Verhalten fünf Jahrzehnten zur Untersuchung der molekularen Mängel, die Dopamin-Regelung verbundenen gefördert. Die meisten dieser Anfragen von Dopamin im Gehirn Verordnung Fokus auf die molekulare Grundlage für die Regulierung in den Terminal-Bereich Regionen der nigrostriatalen und mesoaccumbens Wege; Striatum und Nucleus accumbens. Darüber hinaus haben solche Studien auf der Analyse der Dopamin-Gehalt Gewebe mit einer Normalisierung auf nur feuchten Tuch Gewicht konzentriert. Die Untersuchung der Proteine, die Dopamin regulieren, wie zB Tyrosin-Hydroxylase (TH) Protein, TH-Phosphorylierung, Dopamin-Transporter (DAT), und vesikulären Monoamin-Transporter 2 (VMAT2) Protein oft nicht, eine Analyse der Dopamin-Gehalt im Gewebe der gleichen Probe. Die Fähigkeit, sowohl Dopamin Gewebe Inhalte und deren regulierende Proteine ​​(einschließlich Post-tra analysierennslational Modifikationen) gibt nicht nur innewohnende Kraft der Interpretation der Beziehung von Dopamin mit der Protein-Ebene und die Funktion der TH, DAT oder VMAT2, sondern erstreckt sich auch Probe Wirtschaft. Dies schlägt sich in geringeren Kosten, und doch produziert Einblicke in die molekulare Regulation von Dopamin in praktisch jedem Paradigma der Ermittler Wahl.

Wir fokussieren die Analysen im Mittelhirn. Obwohl die SN und VTA in der Regel in den meisten Studien der Dopamin-Regulierung vernachlässigt werden, werden diese Kerne leicht mit etwas Übung seziert. Eine umfassende Auslesen von Dopamin Gewebe Inhalt und TH-, DAT oder VMAT2 durchgeführt werden kann. Es wird aufkeimende Literatur über die Auswirkungen der Dopamin-Funktion in der SN und VTA auf das Verhalten und die Beeinträchtigungen von körperfremden Substanzen oder Krankheitsprozesse darin ^1-5. Darüber hinaus haben Verbindungen, wie zB Wachstumsfaktoren eine tiefgreifende Wirkung auf Dopamin-und Dopamin-regulierende Proteine, zu einer vergleichsweise größeren Ausmaß in der SN oder VTA <sup> 6-8. Daher wird diese Methode für die Referenz auf Labors, die auf ihre Anfragen auf, wie bestimmte Behandlungen Verhalten modulieren und Dopamin-Regulierung erweitern möchten vorgestellt. Hier wird ein mehrstufiges Verfahren für die Analyse von Gewebe Dopamin-Gehalt, die Proteinexpression von TH, DAT oder VMAT2 und TH-Phosphorylierung aus der Substantia nigra und VTA von Nagetier Mittelhirn vorgestellt. Die Analyse der TH-Phosphorylierung kann wichtige Erkenntnisse über nicht nur, wie TH-Aktivität reguliert wird, sondern auch der Signalkaskaden im somatodendritischen Kerne in einem bestimmten Paradigma beeinflusst zu ergeben.

Wir zeigen die Dissektion Technik, um diese zwei Kerne und die Probe Verarbeitung von präparierten Gewebe, das ein Profil enthüllen molekulare Mechanismen der Dopamin-Regulation in vivo, spezifisch für jede Kerne (Abbildung 1) erzeugt zu trennen.

Protocol

1. Zergliederung Auf einem Bett von Nass-Eis, eine Chill-Nagergehirn Matrix (koronalen Abschnitte getrennt von 1 mm), eine Petrischale mit 5 Rasiermesser und eine Nr. 11 Skalpell. In einem separaten Behälter, beschriftet Platz 2 ml Größe Mikrozentrifugenröhrchen in Trockeneis. Der Prüfer wählt die Methode der Euthanasie. Wir haben reproduzierbare Ergebnisse die Durchführung einer sehr kurzen Narkose mit Isofluran, im Idealfall, ein Verdampfer verwendet werden sollte. Allerdings, wenn nicht ve…

Discussion

Wie in Abbildung 1 dargestellt, sollten die oben genannten Methoden liefern mehrfache Auslesen von Dopamin und dessen regulierende Proteine ​​TH, DAT, und VMAT2 aus einer Probe von SN oder VTA entweder aus der Ratte oder der Maus gewonnen. Auch hier sind die Vorteile der Durchführung dieses Protokoll, dass der Prüfer kann operativ abgestimmt, wie die Messwerte von Dopamin in vivo unter nahezu allen experimentellen Paradigma geregelt und dabei sparen erhebliche experimentellen Ressourcen durch Reduzierung …

Materials

HPLC system:

The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.

The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.

The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.

Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	– J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bromophenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo- Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protein A, specific activity	Perkin-Elmer

Table 2. Specific reagents.

Reagents	Formulas
10% SDS	10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)	10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution	1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer	Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer	Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)	Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)	Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau	Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution	5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)	PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)	Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g

Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.

Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock ¹¹.