Summary

פרופיל מקיף של הסדרת substantia nigra הדופמין ואזור Tegmental הגחון

Published: August 10, 2012
doi:

Summary

דופאמין הוא מוסדר בבירור בגרעין המוח התיכון, אשר מכילים תאים הגופות דנדריטים של נוירונים דופאמין. כאן נתאר את הגישה לנתיחה ו מדגם הטיפול על מנת למקסם את התוצאות, ולכן מסקנות ותובנות, על ויסות הדופמין בגרעין המוח התיכון של nigra substantia (SN) ואזור tegmental הגחוני (VTA) במכרסמים.

Abstract

דופמין הוא מוליך עצבי למד במרץ מערכת העצבים המרכזית. אכן, את מעורבותה בפעילות של תנועה ותגמול הקשור להתנהגות טיפחה חמישה עשורים החקירה לעניין הליקויים מולקולריים הקשורים תקנה דופמין. רוב אלה שאלות של רגולציה הדופמין במוח המיקוד על הבסיס המולקולרי של ויסות שלה את שדה באזורים מסוף המסלולים nigrostriatal ו mesoaccumbens, הסטריאטום ו הנסמך הגרעין. יתרה מכך, מחקרים אלה התמקדו בניתוח תוכן רקמות דופמין נורמליזציה עם משקל רק רקמות רטוב. חקירת החלבונים המווסתים דופמין, כגון hydroxylase החלבון טירוזין (ה '), זירחון TH, טרנספורטר דופאמין (DAT), ו טרנספורטר אוקסידאז שלפוחי 2 (VMAT2) חלבון לעתים קרובות אינם כוללים ניתוח של תוכן רקמות הדופמין מדגם זהה. היכולת לנתח את תוכן הן רקמות דופאמין חלבונים המסדירים שלה (כולל פוסט traשינויים nslational) לא רק נותן כוח אינהרנטי לפרש את הקשר של דופמין עם רמת חלבון והתפקוד של TH, DAT, או VMAT2, אלא גם מרחיב את הכלכלה המדגם. זה מיתרגם עלות פחות, ובכל זאת מייצרת תובנות תקנה המולקולרי של הדופמין הפרדיגמה כמעט כל בחירה של החוקרים.

אנו מתמקדים בניתוח של המוח התיכון. למרות SN ו VTA מוזנחים בדרך כלל רוב המחקרים תקנה דופמין, גרעינים אלה גזור בקלות עם הפרקטיקה. Readout מקיפה של תוכן רקמות TH דופאמין, DAT, או VMAT2 ניתן לבצע. שם הוא המתפתחת ספרות על ההשפעה של תפקוד הדופאמין SN ו VTA על ההתנהגות, ועל הפרעות וחדירות חיצוניות של חומרים חיצוניים או תהליכי מחלה החלים בהם 1-5. יתר על כן, תרכובות כגון גורמי גדילה יש השפעה עמוקה על חלבונים דופאמין דופאמין מווסת במידה יחסית רבה יותר SN או VTA <sup> 6-8. לכן, שיטה זו מוצג לעיון למעבדות אשר רוצים להרחיב את השאלות שלהם על כמה טיפולים ספציפיים לווסת התנהגות ורגולציה דופמין. הנה, שיטת רב שלבי מוצג על ניתוח תוכן רקמות דופמין, רמות החלבון של TH, DAT, או VMAT2 ו זרחון TH מ nigra substantia ו VTA מן המוח התיכון מכרסם. ניתוח של זירחון TH יכולה להניב תובנות משמעותיות לתוך לא רק כיצד הפעילות TH מוסדר, אלא גם את מפלי איתות מושפע בגרעין somatodendritic פרדיגמה נתונה.

אנו מדגימים את הטכניקה לנתיחה כדי לבודד אותם גרעינים 2 ו עיבוד דגימת רקמה גזור שמייצר פרופיל חושף מנגנונים מולקולריים תקנה דופמין in vivo, ספציפיות עבור כל גרעינים (איור 1).

Protocol

1. בתור על מצע של קרח רטוב, לצנן המוח מכרסם מטריקס (סעיפים העטרה הפרדה 1 מ"מ זה מזה), צלחת פטרי המכילה 5 סכיני גילוח, ו # 11 אזמל. בכלי נפרד, במקום הנקרא 2 גודל מ"ל צינורות microfuge אל קרח יבש. החוקר …

Discussion

כפי שמתואר באיור 1, השיטות שפורטו לעיל צריך להניב readouts רבים של דופאמין ויסות שלה חלבונים ה, DAT, ו VMAT2 ממדגם אחד או SN VTA לקבל חולדה או עכבר. שוב, היתרונות של ביצוע זה הן כי פרוטוקול החוקר יכול להשיג readouts מבצעית המותאמות של כמה דופמין מוסדר in vivo תחת הפרדיגמה כמעט כל ניסי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מימון עבור עבודה זו, וכפי שצוטט 2,10, נקבע, בין השאר, על ידי פרסים מחקר להעניק MF סלווטורה של הפדרציה האמריקאית לחקר הזיקנה, אדוארד פ 'סטיילס אמון הקרן ביו קרן המחקר של מערב לואיזיאנה, וכדי BS פרואט מן אחוות אייק Muslow Predoctoral, LSU למדעי הבריאות מרכז, Shreveport.

Materials

HPLC system:

The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.

The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.

The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.

Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.

Name of the reagent Company Catalogue number
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) – J.T. Baker 4095-02
Trizma Base Sigma T1503-1KG
Trizma HCl Sigma T3253-1KG
Glycerol Sigma G8773-500 mL
PVP-40 Sigma PVP40-1KG
dPBS Gibco 21600-069
Tween20 Sigma P1379-500 mL
Glycine Sigma G8898-1KG
Ponceau S Fluka 81460
Bromophenol Blue Sigma B8026-5G
Dithiothreitol Sigma D-9163
Protein Standard 2 mg BSA Sigma P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A Thermo- Fisher Scientific 23223
Precision Plus Protein Standard Bio Rad 161-0373
[125I]-protein A, specific activity Perkin-Elmer  

Table 2. Specific reagents.

Reagents Formulas
10% SDS 10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)
  1. 10 mL 10%SDS
  2. 60.5 mg Trizma Base
  3. 37.22 mg EDTA
  4. 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution
  1. 1 g Copper II sulfate
  2. 25 mL DI H20
3X Sample Buffer
  1. Trizma Base 2.27 g
  2. SDS 6 g
  3. Dithiothreitol 0.463 g
  4. Glycerol 30 g
  5. Bromophenol Blue 10 mg
  6. D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL)
  7. HCl (add as needed to reach pH of 6.85)
  8. Freeze solution in 50 2.0 mL tubes.
(makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)
  1. Trizma Base 121.1 g
  2. Glycine 577 g
  3. SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)
  1. Glycine 360 g
  2. Trizma Base 96 g
Ponceau
  1. Ponceau S. 0.5 g
  2. Acetic Acid 5 mL
  3. DI H20 95 mL
.2% HCl Solution 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)
  1. PVP-40 40 g
  2. dPBS 38.2 g
  3. Tween20 2 g
  4. Thimerisol 0.4 g
  5. 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)
  1. Tween 20 20 g
  2. Tris Base 14 g
  3. Tris HCl 61 g

Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.

Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.

References

  1. Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
  2. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation. PLoS ONE. 4, e8466 (2009).
  3. Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. Dopamine controls persistence of long-term memory storage. Science. 325, 1017-1020 (2009).
  4. Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat. Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).
  5. Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal. J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).
  6. Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).
  7. Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra. J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).
  8. Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving. Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).
  9. Lavicky, J., Dunn, A. J. Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis. J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).
  10. Salvatore, M. F., Pruett, B. S. Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways. PLoS ONE. 7, e29867 (2012).
  11. Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds. J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).
  12. Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ. J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).
  13. Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis. J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).
  14. Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum. J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).
check_url/kr/4171?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area. J. Vis. Exp. (66), e4171, doi:10.3791/4171 (2012).

View Video