ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質(SN)とげっ歯類では腹側被蓋野(VTA)の中脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。
ドーパミンは中枢神経系で精力的に研究神経伝達物質である。確かに、その自発運動への関与と報酬に関連する動作は、ドーパミン調節に関連する分子の不備にお問い合わせの五十年を促進しています。線条体および側坐核、黒質線条体とmesoaccumbens経路のターミナルフィールド領域におけるその調節の分子基盤に応じて脳フォーカスのドーパミン調節のこれらの問い合わせが多数。さらに、このような研究が唯一のウェットティッシュの重量に正規化とドーパミン組織含有量の分析に集中している。そのようなチロシンヒドロキシラーゼ(TH)タンパク質、THのリン酸化、ドーパミントランスポーター(DAT)、および小胞モノアミン輸送体2(VMAT2)タンパク質として、ドーパミン調節するタンパク質の研究は、しばしば同一のサンプルにおけるドーパミン組織含有量の分析が含まれていません。ドーパミン組織のコンテンツとその調節タンパク質(ポスト-TRAを含む両方を分析する能力nslational変更)TH、DATのタンパク質レベルと機能とドーパミンの関係を解釈する固有の力を与える、またはVMAT2だけでなく、サンプルの経済を拡張するだけでなく。この低コストに変換し、さらには研究者の選択の事実上すべてのパラダイムにおけるドーパミンの分子制御への洞察を生成します。
我々は中脳での分析の焦点を合わせる。 SNとVTAは、通常、ドーパミン調節のほとんどの研究では無視されていますが、これらの核は簡単に実践して解剖されています。包括的なドーパミン組織のコンテンツとTHの読み出し、DAT、またはVMAT2を行うことができる。そこに行動上のSNとVTAのドーパミン機能の影響に関する文献を急成長し、そこに1から5外因性物質または疾患過程のimpingementsされています。さらに、成長因子などの化合物は、SNまたはVTAで比較的大きい程度に、ドーパミンやドーパミン調節蛋白質に大きな影響を持っている<sup> 6-8したがって、この方法論は、特定の治療法は行動とドーパミンの調節を調節する方法でそれらの照会を拡張する研究室への参照のために提示されています。ここでは、マルチステップ法がげっ歯類の脳から黒質およびVTAドーパミン組織からコンテンツの分析、THのタンパク質レベル、DAT、またはVMAT2、およびTHリン酸化のために提示されています。 THリン酸化の解析だけではなく、TH活性が調節されている方法ではなく、与えられたパラダイムの細胞体核に影響を受けたシグナル伝達カスケードに重要な洞察を得ることができます。
我々は、これらの2つの核とそれぞれの原子核(図1)の特定のin vivoでのドーパミン調節の分子機構を明らかにプロファイルを生成し、解剖組織サンプル処理を分離するために解剖の手法を説明します。
図1に概説され、上記詳述した方法は、ドーパミンの複数の読み出しおよびラットまたはマウスから得られたSNまたはVTAの1つのサンプルから、その調節タンパク質TH、DAT、およびVMAT2を生成する必要があります。再び、このプロトコルを実施する利点は、研究者はドーパミンが実質的にすべての実験的なパラダイムの下でin vivoでの規制と、そうすることで、いずれかに必要な動物数?…
The authors have nothing to disclose.
この作品、として2,10を挙げて 、のための資金は、老化研究、エドワード·P.スタイルズ信託基金とノースウエストルイジアナ州の医学研究財団のためのアメリカ連合からMFサルバトーレの研究助成賞を受賞することによって、部分的には、提供されていましたとBSプルエットにアイクMuslow博士号を取得する前のフェローシップ、LSUの健康科学センターシュリーブポートから。
HPLC system:
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.
The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.
Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | – J.T. Baker | 4095-02 |
Trizma Base | Sigma | T1503-1KG |
Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG |
Glycerol | Sigma | G8773-500 mL |
PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG |
dPBS | Gibco | 21600-069 |
Tween20 | Sigma | P1379-500 mL |
Glycine | Sigma | G8898-1KG |
Ponceau S | Fluka | 81460 |
Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G |
Dithiothreitol | Sigma | D-9163 |
Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL |
Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo- Fisher Scientific | 23223 |
Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 |
[125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer |
Table 2. Specific reagents.
Reagents | Formulas |
10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 |
1% SDS (pH to 8.2) |
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Copper II Sulfate Solution |
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3X Sample Buffer |
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1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 |
10X Running Buffer (Makes 4 L) |
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10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) |
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Ponceau |
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.2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 |
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) |
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10X Blot Buffer (Makes 4 L) |
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Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.