Dopamin er tydelig regulert i midbrain kjerner, som inneholder cellen organer og dendritter av dopamin nerveceller. Her beskriver vi en disseksjon og prøvehåndtering tilnærming for å maksimere resultater, og dermed konklusjoner og innsikt, på dopamin regulering i midbrain kjerner av substantia nigra (SN) og ventral tegmentale området (VTA) i gnagere.
Dopamin er en kraftig studert nevrotransmitter i CNS. Faktisk har sitt engasjement i locomotor aktivitet og belønning-relatert adferd fostret fem tiår med granskningen av molekylære manglene knyttet dopamin regulering. De fleste av disse forespørslene av dopamin regulering i hjernen fokus på det molekylære grunnlaget for sin regulering i de terminale feltet delene av nigrostriatal og mesoaccumbens stier, striatum og nucleus accumbens. Videre har slike studier konsentrert seg om analyse av dopamin vev innhold med normalisering å bare våt vev vekt. Undersøkelse av proteiner som regulerer dopamin, som tyrosin hydroksylase (TH) protein, TH fosforylering, dopamin transporter (DAT), og vesicula monoamine Transporter 2 (VMAT2) protein ofte ikke omfatte analyse av dopamin vev innhold på samme prøve. Evnen til å analysere både dopamin vev innhold og dens regulerende proteiner (inkludert post-translational modifikasjoner) ikke bare gir iboende kraft til å tolke forholdet mellom dopamin med protein nivå og funksjon av TH, DAT, eller VMAT2, men også strekker prøven økonomi. Dette oversettes til lavere kostnader, og likevel produserer innsikt i den molekylære reguleringen av dopamin i praktisk talt alle paradigme av etterforskerne valg.
Vi fokuserer analysene i midbrain. Selv om SN og VTA er vanligvis neglisjert i de fleste studier av dopamin regulering, er disse kjerner lett dissekert med praksis. En omfattende avlesning av dopamin vev innhold og TH, DAT, eller VMAT2 kan gjennomføres. Det er voksende litteratur om virkningen av dopamin funksjon i SN og VTA på atferd, og de impingements av eksogene stoffer eller sykdomsprosesser journalopplysninger 1-5. Videre forbindelser som for eksempel vekstfaktorer ha en dyp effekt på dopamin og dopamin-regulerende proteiner, til en forholdsvis større grad i SN eller VTA <sup> 6-8. Derfor er denne metoden presenteres for referanse til laboratorier som ønsker å utvide sine henvendelser om hvordan spesifikke behandlinger modulere atferd og dopamin regulering. Her er en multi-trinn metode presenteres for analysene av dopamin vev innhold, proteinet nivåer av TH, DAT, eller VMAT2 og TH fosforylering fra substantia nigra og VTA fra gnager midbrain. Analysen av TH fosforylering kan gi betydelige innsikt ikke bare hvordan TH aktivitet er regulert, men også de signaliserer kaskader berørt i somatodendritic kjerner i en gitt paradigme.
Vi vil illustrere disseksjon teknikk for å skille disse to kjerner og prøvebehandling av dissekert vev som produserer en profil avslørende molekylære mekanismer av dopamin regulering in vivo, spesifikke for hver kjerner (figur 1).
Som beskrevet i figur 1, bør metodene beskrevet ovenfor gi flere avlesninger av dopamin og dens regulere proteiner TH, DAT, og VMAT2 fra en prøve av SN eller VTA hentet fra enten rotte eller mus. Igjen, fordelene ved å gjennomføre denne protokollen er at undersøkeren kan få operasjonelt-matchede analysering av hvordan dopamin er regulert in vivo etter nesten alle eksperimentelle paradigmet, og dermed spare betydelige eksperimentelle ressurser ved å redusere antall dyr som kreves i noen eksperiment.
<…The authors have nothing to disclose.
Midler til dette arbeidet, og som sitert 2,10, ble gitt, delvis ved et forskningsstipend tildelinger til MF Salvatore fra American Federation for Aging Research, The Edward P. Stiles Trust Fund og Biomedical Research Foundation of Northwest Louisiana, og til BS Pruett fra Ike Muslow Predoctoral Fellowship, LSU Health Sciences Center-Shreveport.
HPLC system:
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.
The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.
Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | – J.T. Baker | 4095-02 |
Trizma Base | Sigma | T1503-1KG |
Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG |
Glycerol | Sigma | G8773-500 mL |
PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG |
dPBS | Gibco | 21600-069 |
Tween20 | Sigma | P1379-500 mL |
Glycine | Sigma | G8898-1KG |
Ponceau S | Fluka | 81460 |
Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G |
Dithiothreitol | Sigma | D-9163 |
Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL |
Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo- Fisher Scientific | 23223 |
Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 |
[125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer |
Table 2. Specific reagents.
Reagents | Formulas |
10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 |
1% SDS (pH to 8.2) |
|
Copper II Sulfate Solution |
|
3X Sample Buffer |
|
1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 |
10X Running Buffer (Makes 4 L) |
|
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) |
|
Ponceau |
|
.2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 |
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) |
|
10X Blot Buffer (Makes 4 L) |
|
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.