Profiling abrangente do Regulamento dopamina em substância negra e área tegmental ventral

Summary

A dopamina é distintamente regulada nos núcleos mesencéfalo, que contêm a célula corpos e dendrites de os neurónios de dopamina. Descrevemos aqui uma abordagem dissecção e manipulação da amostra para maximizar os resultados, e, assim, conclusões e compreensão, na regulação da dopamina nos núcleos mesencéfalo da substantia nigra (SN) e área tegmental ventral (VTA) em roedores.

Abstract

A dopamina é um neurotransmissor vigorosamente estudada no SNC. Na verdade, o seu envolvimento na atividade locomotora e recompensa comportamentos relacionados promoveu cinco décadas de investigação sobre as deficiências moleculares associados com a regulação da dopamina. A maioria destas investigações de regulação de dopamina no cérebro o foco sobre a base molecular para a sua regulação em regiões terminais de campo das vias nigrostiatais e mesoaccumbens; estriado e nucleus accumbens. Além disso, esses estudos têm-se concentrado na análise do teor de tecido da dopamina, com normalização ao peso do tecido apenas molhado. Investigação das proteínas que regulam a dopamina, tais como tirosina hidroxilase (TH), proteína de fosforilação TH, do transportador de dopamina (DAT) e transportador monoamina vesicular 2 (VMAT2) proteína muitas vezes não incluem a análise do teor de dopamina no tecido da mesma amostra. A capacidade de analisar tanto o conteúdo do tecido da dopamina e suas proteínas de regulação (incluindo pós-tramodificações nslational) não só dá o poder inerente ao interpretar a relação da dopamina com o nível da proteína ea função de TH, DAT, ou VMAT2, mas também se estende economia amostra. Isso se traduz em menor custo, e ainda produz insights sobre a regulação molecular da dopamina em praticamente qualquer paradigma de escolha dos investigadores.

Nós nos concentramos nas análises no mesencéfalo. Embora o SN e VTA são normalmente negligenciados na maioria dos estudos de regulação da dopamina, esses núcleos são facilmente dissecados com a prática. Uma leitura abrangente do conteúdo tecido dopamina e TH, DAT, ou VMAT2 pode ser realizado. Não é florescente literatura sobre o impacto da função dopaminérgica no SN e VTA sobre o comportamento, e as imposições de substâncias exógenas ou processos doença nisso ^1-5. Além disso, os compostos, tais como factores de crescimento têm um efeito profundo sobre as proteínas da dopamina e da dopamina-regulador, a uma extensão comparativamente maior no SN ou VTA <sup> 6-8. Portanto, esta metodologia é apresentada como referência para laboratórios que desejam estender suas investigações sobre como tratamentos específicos modular o comportamento e regulação da dopamina. Aqui, um método multi-passo é apresentado para as análises de teor de tecido de dopamina, os níveis proteicos de TH, DAT ou VMAT2 e fosforilação TH da substantia nigra e VTA do mesencéfalo de roedores. A análise da fosforilação TH pode produzir insights significativos em não só como actividade TH é regulada, mas também as cascatas de sinalização afectadas nos núcleos somatodendritic num dado paradigma.

Iremos ilustrar a técnica de dissecação para segregar estes núcleos duas eo processamento da amostra de tecido dissecado que produz um perfil revelando mecanismos moleculares de regulação da dopamina in vivo, específicas para cada núcleos (Figura 1).

Protocol

1. Dissecação Sobre um leito de gelo-molhado, arrefecer uma matriz cérebro de roedores (secções coronais segregados 1 milímetro de intervalo), uma placa de Petri contendo 5 lâminas de barbear, e um bisturi # 11. Num recipiente separado, o local de rotulado 2 ml tubos de microcentrífuga de dimensão em gelo seco. O investigador vai escolher o método de eutanásia. Temos resultados reprodutíveis conduzindo uma anestesia muito breve com isoflurano, idealmente, um vaporizador deve ser usado. N…

Discussion

Conforme descrito na Figura 1, os métodos descritos acima devem produzir leituras múltiplas de dopamina e da sua regulação TH proteínas, DAT e VMAT2 a partir de uma amostra de SN ou VTA obtido a partir de qualquer um rato ou ratinho. Novamente, os benefícios de levar a cabo este protocolo são que o investigador pode obter leituras operacionalmente-combinados de como a dopamina é regulada in vivo sob virtualmente qualquer paradigma experimental e, ao fazê-lo, salvo significativas meios experimentais, re…

Materials

HPLC system:

The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.

The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.

The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.

Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	– J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bromophenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo- Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protein A, specific activity	Perkin-Elmer

Table 2. Specific reagents.

Reagents	Formulas
10% SDS	10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)	10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution	1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer	Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer	Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)	Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)	Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau	Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution	5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)	PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)	Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g

Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.

Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock ¹¹.