Dopamin distinkt regleras i mitthjärnan kärnor, som innehåller cellkropparna och dendriter av dopaminneuroner. Här beskriver vi ett dissektion och prov-hantering strategi för att maximera resultat och därmed slutsatser och insikter, om dopamin reglering i mitthjärnan kärnor av substantia nigra (SN) och ventrala tegmentumområdet (VTA) hos gnagare.
Dopamin är en kraftigt studerades neurotransmittorn i CNS. I själva verket har dess inblandning i rörelseaktivitet och belöning-beteende främjas fem decennier av undersökning av molekylära brister som är förknippade med dopamin reglering. Majoriteten av dessa undersökningar av dopamin reglering i hjärnan fokus på den molekylära grunden för dess reglering i de regioner terminala området för nigrostriatala och mesoaccumbens vägar, striatum och nucleus accumbens. Dessutom har sådana studier koncentrerat sig på analys av dopamin vävnad innehåll med normalisering att endast våt vävnad vikt. Undersökningen av de proteiner som reglerar dopamin, såsom tyrosinhydroxylas (TH)-protein, TH fosforylering, dopamintransportören (DAT), och vesikulärt monoamintransporterfunktionen 2 (VMAT2) proteinet ofta innefattar inte analys av dopamin vävnadshalt i samma prov. Förmågan att analysera både dopamin vävnad innehåll och dess reglerar proteiner (inklusive post-translational ändringar) ger inte bara inneboende kraft att tolka förhållandet mellan dopamin med proteinet nivån och funktion TH, DAT eller VMAT2, men sträcker sig även prov ekonomi. Detta leder till mindre kostnad, och ändå producerar insikter i molekylära regleringen av dopamin i praktiskt taget alla paradigm av utredarnas val.
Vi fokuserar analyserna i mitthjärnan. Även om SN och VTA normalt försummas i de flesta studier av dopamin förordning skall dessa kärnor enkelt dissekerade med praktik. En omfattande utläsning av dopamin vävnadshalt och TH, DAT, eller VMAT2 kan utföras. Det finns spirande litteratur om effekterna av dopamin funktion i SN och VTA på beteende och impingements av exogena ämnen eller processer sjukdom däri 1-5. Dessutom föreningar såsom tillväxtfaktorer har en djupgående effekt på dopamin och dopamin-reglerande proteiner, till en jämförelsevis större utsträckning i SN och VTA <sup> 6-8. Därför är denna metod presenteras för hänvisning till laboratorier som vill utvidga sina undersökningar på hur särskilda behandlingar modulera beteende och dopamin reglering. Här är en multi-steg-metoden presenteras för analys av dopamin vävnadshalt de proteinnivåer på TH, DAT, eller VMAT2 och TH fosforylering från substantia nigra och VTA från gnagare mitthjärnan. Analysen av TH-fosforylering kan ge signifikanta insikter i sig inte bara TH-aktiviteten regleras utan även de signalkaskader påverkas i den somatodendritiska kärnorna i en given paradigm.
Vi kommer att illustrera dissektionen tekniken att avskilja dessa två kärnor och provet bearbetning av de dissekerade vävnad som producerar en profil avslöjar molekylära mekanismer av dopamin reglering in vivo, specifika för varje kärnor (figur 1).
Som visas i figur 1, bör de metoder som beskrivs ovan ger flera avläsningar av dopamin och dess reglering proteiner TH, DAT, och VMAT2 från ett urval av Sn eller VTA erhålls från antingen råtta eller mus. Återigen, fördelarna med att genomföra detta protokoll är att utredaren kan få operativt-matchade avläsning av hur dopamin regleras in vivo under praktiskt taget alla experimentella paradigm och därigenom spara stora experimentella resurser genom att minska antalet djur som krävs i varje experime…
The authors have nothing to disclose.
Finansiering för detta arbete, och som målet 2,10, lämnades, delvis genom ett forskningsanslag tilldelar MF Salvatore från den amerikanska Federation for Aging Research, Edward P. Stiles fonden och biomedicinsk forskning Stiftelsen för Northwest Louisiana, och BS Pruett från Ike Muslow Predoctoral Fellowship, LSU Health Sciences Center-Shreveport.
HPLC system:
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.
The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.
Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | – J.T. Baker | 4095-02 |
Trizma Base | Sigma | T1503-1KG |
Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG |
Glycerol | Sigma | G8773-500 mL |
PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG |
dPBS | Gibco | 21600-069 |
Tween20 | Sigma | P1379-500 mL |
Glycine | Sigma | G8898-1KG |
Ponceau S | Fluka | 81460 |
Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G |
Dithiothreitol | Sigma | D-9163 |
Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL |
Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo- Fisher Scientific | 23223 |
Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 |
[125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer |
Table 2. Specific reagents.
Reagents | Formulas |
10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 |
1% SDS (pH to 8.2) |
|
Copper II Sulfate Solution |
|
3X Sample Buffer |
|
1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 |
10X Running Buffer (Makes 4 L) |
|
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) |
|
Ponceau |
|
.2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 |
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) |
|
10X Blot Buffer (Makes 4 L) |
|
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.