Omfattende profilering av Dopamin forordning i substantia nigra og Ventral tegmentale området

Summary

Dopamin er tydelig regulert i midbrain kjerner, som inneholder cellen organer og dendritter av dopamin nerveceller. Her beskriver vi en disseksjon og prøvehåndtering tilnærming for å maksimere resultater, og dermed konklusjoner og innsikt, på dopamin regulering i midbrain kjerner av substantia nigra (SN) og ventral tegmentale området (VTA) i gnagere.

Abstract

Dopamin er en kraftig studert nevrotransmitter i CNS. Faktisk har sitt engasjement i locomotor aktivitet og belønning-relatert adferd fostret fem tiår med granskningen av molekylære manglene knyttet dopamin regulering. De fleste av disse forespørslene av dopamin regulering i hjernen fokus på det molekylære grunnlaget for sin regulering i de terminale feltet delene av nigrostriatal og mesoaccumbens stier, striatum og nucleus accumbens. Videre har slike studier konsentrert seg om analyse av dopamin vev innhold med normalisering å bare våt vev vekt. Undersøkelse av proteiner som regulerer dopamin, som tyrosin hydroksylase (TH) protein, TH fosforylering, dopamin transporter (DAT), og vesicula monoamine Transporter 2 (VMAT2) protein ofte ikke omfatte analyse av dopamin vev innhold på samme prøve. Evnen til å analysere både dopamin vev innhold og dens regulerende proteiner (inkludert post-translational modifikasjoner) ikke bare gir iboende kraft til å tolke forholdet mellom dopamin med protein nivå og funksjon av TH, DAT, eller VMAT2, men også strekker prøven økonomi. Dette oversettes til lavere kostnader, og likevel produserer innsikt i den molekylære reguleringen av dopamin i praktisk talt alle paradigme av etterforskerne valg.

Vi fokuserer analysene i midbrain. Selv om SN og VTA er vanligvis neglisjert i de fleste studier av dopamin regulering, er disse kjerner lett dissekert med praksis. En omfattende avlesning av dopamin vev innhold og TH, DAT, eller VMAT2 kan gjennomføres. Det er voksende litteratur om virkningen av dopamin funksjon i SN og VTA på atferd, og de ​​impingements av eksogene stoffer eller sykdomsprosesser journalopplysninger ^1-5. Videre forbindelser som for eksempel vekstfaktorer ha en dyp effekt på dopamin og dopamin-regulerende proteiner, til en forholdsvis større grad i SN eller VTA <sup> 6-8. Derfor er denne metoden presenteres for referanse til laboratorier som ønsker å utvide sine henvendelser om hvordan spesifikke behandlinger modulere atferd og dopamin regulering. Her er en multi-trinn metode presenteres for analysene av dopamin vev innhold, proteinet nivåer av TH, DAT, eller VMAT2 og TH fosforylering fra substantia nigra og VTA fra gnager midbrain. Analysen av TH fosforylering kan gi betydelige innsikt ikke bare hvordan TH aktivitet er regulert, men også de signaliserer kaskader berørt i somatodendritic kjerner i en gitt paradigme.

Vi vil illustrere disseksjon teknikk for å skille disse to kjerner og prøvebehandling av dissekert vev som produserer en profil avslørende molekylære mekanismer av dopamin regulering in vivo, spesifikke for hver kjerner (figur 1).

Protocol

1. Disseksjon På en seng av våt is, chill en gnager hjerne matrise (koronale deler segregert 1 mm fra hverandre), en petriskål inneholder 5 barberhøvler, og en 11 skalpell. I en egen beholder, merkes plass 2 ml størrelse microfuge rør inn tørris. Etterforskeren vil velge metode for aktiv dødshjelp. Vi har reproduserbare resultater gjennomfører en meget kort anestesi med isofluran, Ideelt sett bør en vaporizer brukes. Men hvis ikke er tilgjengelig, bruker vi et stort batteri krukke innehold…

Discussion

Som beskrevet i figur 1, bør metodene beskrevet ovenfor gi flere avlesninger av dopamin og dens regulere proteiner TH, DAT, og VMAT2 fra en prøve av SN eller VTA hentet fra enten rotte eller mus. Igjen, fordelene ved å gjennomføre denne protokollen er at undersøkeren kan få operasjonelt-matchede analysering av hvordan dopamin er regulert in vivo etter nesten alle eksperimentelle paradigmet, og dermed spare betydelige eksperimentelle ressurser ved å redusere antall dyr som kreves i noen eksperiment.

<…

Materials

HPLC system:

The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.

The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.

The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.

Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	– J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bromophenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo- Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protein A, specific activity	Perkin-Elmer

Table 2. Specific reagents.

Reagents	Formulas
10% SDS	10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)	10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution	1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer	Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer	Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)	Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)	Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau	Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution	5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)	PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)	Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g

Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.

Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock ¹¹.